PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞減輕缺血性腦損傷和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

陳 慧 鄭曉梅 夏 曉 孫玉錦 徐 靜

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州 646000)

腦血管疾病的致死率與致殘率在所有疾病中位居第二，且發(fā)病率逐年上升，有可能成為導(dǎo)致死亡的首要疾病，其致死率與致殘率在我國(guó)位居第一[1-3]。在所有腦血管疾病中，缺血性腦卒中的發(fā)病率位居第一，具有起病急、難預(yù)測(cè)、致死率與致殘率高的特點(diǎn)，缺血性腦卒中的預(yù)防與治療一直是臨床研究重點(diǎn)。目前FDA批準(zhǔn)的缺血性腦卒中治療方式為靜脈注射重組組織纖溶酶原激活物，但多數(shù)患者并未獲益[4-5]。除短期的溶栓治療窗外，目前仍無(wú)證據(jù)表明該干預(yù)可有效促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)。

干細(xì)胞療法是治療腦卒中的潛在策略，相關(guān)研究已證明干細(xì)胞移植治療可改善缺血性腦卒中患者的療效，但目前對(duì)干細(xì)胞移植修復(fù)缺血性腦卒中的作用機(jī)制仍不明確[6-7]。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCBMSCs)具有獲取無(wú)痛、免疫耐受高、無(wú)倫理爭(zhēng)議等特點(diǎn)，成為細(xì)胞移植治療的較好選擇。研究證明PI3K/Akt信號(hào)通路與缺血性腦卒中關(guān)系密切，但UCBMSCs對(duì)缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用是否與該通路相關(guān)尚未明確。本研究觀察人UCBMSCs對(duì)大鼠缺血性腦損傷的保護(hù)作用，分析UCBMSCs對(duì)缺血性腦損傷患者PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臍血 由我院婦產(chǎn)科提供，來(lái)自健康足月嬰兒，孕產(chǎn)婦血常規(guī)與感染免疫9項(xiàng)檢查均正常，產(chǎn)婦及其家屬知情同意。無(wú)菌條件下共采集臍血10份，每份80 ml，加入25 U/ml肝素抗凝。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠70只，體重(260±25)g，飼養(yǎng)于25℃、光12 h/暗12 h環(huán)境中，自由飲食。

1.1.3主要試劑與儀器 Akt1/2/3抗體抑制劑GSK2141795(EYK-CAS0019337，廈門(mén)研科生物技術(shù)有限公司)；DMEM-LG培養(yǎng)液(129075-73-6，上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(深圳市浩克生物技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀(BriCyte E6，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；CD105-APC抗體(MHCD10505)、CD90-APC抗體(A15726)和CD30-APC抗體(A15715，Invitrogen)；AKT1/2/3抗體(AP20658c，百奇生物科技(蘇州)有限公司)；Western blot檢測(cè)試劑盒(xyW001，上海信裕生物科技有限公司)；ELISA檢測(cè)試劑盒(YOYOBIO，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)；Bcl-2抗體(ab692)、Bax抗體(ab32503，Abcam)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(SNM537-OSJ，北京百奧萊博科技有限公司) 。

1.2方法

1.2.1UCBMSCs提取、培養(yǎng) 取新生兒臍血，以1∶1.5比例加入D-Hank′s 緩沖液稀釋?zhuān)埔浩鞔荡蚓鶆颍?5℃下2 000 r/min離心15 min，吸取界面細(xì)胞層；D-Hank′s 緩沖液清洗1次，25℃下1 500 r/min離心8 min，棄上清，取細(xì)胞沉淀，加入含5%胎牛血清、2 mol/L L-谷氨酰胺與100 U/ml青-鏈霉素的DMEM-LG培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×107個(gè)/ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)按1∶2 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每4 d半量換液1次，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。將第3代UCBMSCs以鼠抗人細(xì)胞系特異性抗體MAB1281標(biāo)記，進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)[8]。

1.2.2UCBMSCs鑒定 取第3代UCBMSCs，胰酶消化，以PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD105、CD90和CD30表面標(biāo)記物表達(dá)，誘導(dǎo)UCBMSCs向成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化[9]。

1.2.3構(gòu)建腦損傷模型 取SD大鼠稱(chēng)體重，腹腔注射3.6%水合氯醛10 ml/kg麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒、鋪巾，在頸部正中皮膚做4 cm左右切口，假手術(shù)組分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)與頸外后直接縫合切口；腦損傷組制作大腦中動(dòng)脈缺血模型，于右側(cè)頸總動(dòng)脈基底部結(jié)扎血管，并用動(dòng)脈瘤夾夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈，在右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈根部剪1個(gè)斜形小口，向內(nèi)緩緩插入線栓，當(dāng)插入線栓到達(dá)預(yù)定深度時(shí)打開(kāi)動(dòng)脈瘤夾，繼續(xù)插入出現(xiàn)阻滯感時(shí)迅速結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，45 min 后拔除線栓，逐層關(guān)閉切口、縫合皮膚。以Z-Longa神經(jīng)功能評(píng)分1～3分為造模成功[10]。

1.2.4人UCBMSCs的腦保護(hù)作用檢測(cè) 將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦損傷組、UCBMSCs組，每組10只。缺血性腦損傷造模成功后24 h，腦損傷組于左側(cè)股靜脈注射1 ml生理鹽水，UCBMSCs組左側(cè)股靜脈注射等體積UCBMSCs生理鹽水溶液，細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。術(shù)后1、3、7、14 d采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分評(píng)估大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，包括評(píng)估運(yùn)動(dòng)能力、感覺(jué)能力、平衡能力與異常活動(dòng)能力，總分18分，評(píng)分越高說(shuō)明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。術(shù)后1、3、7、14 d尾靜脈取血1 ml、8℃、1 000 r/min離心15 min，取上清，ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-6、TGF-β水平。

1.2.5尼氏染色 術(shù)后14 d斷頭取腦海馬組織，40 g/L多聚甲醛固定24 h，制備石蠟切片(25 μm)，脫蠟入水，甲基紫染色15 min，蒸餾水沖洗3次，梯度乙醇脫水，Nissl Differentiation染色液分化8 s，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固，顯微鏡下觀察。

1.2.6免疫熒光染色 術(shù)后14 d取UCBMSCs組海馬組織，制作冰凍切片，加入抗MAB1281抗體(1∶125)與NeuN抗體(1∶50)混合抗體，4℃孵育24 h 后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100)與PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶100)混合抗體孵育，DAPI復(fù)染，甘油封固后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7UCBMSCs對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響 將40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦損傷組、UCBMSCs組與抑制劑組，每組10只。缺血性腦損傷造模成功后24 h，模型組于左側(cè)股靜脈注射1 ml生理鹽水，UCBMSCs組左側(cè)股靜脈注射等體積UCBMSCs生理鹽水，細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml；抑制劑組左側(cè)股靜脈注射0.1 ml Akt1/2/3抗體抑制劑GSK2141795與1 ml UCBMSCs生理鹽水，細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。術(shù)后14 d處死大鼠。

1.2.8Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取大鼠部分腦組織制作2 mm切片，取切片缺血區(qū)腦組織10%甲醛固定，制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟，滴加4%H2O2后25℃保存10 min，蒸餾水沖洗3次，加入蛋白酶36℃消化15 min，PBS清洗，36℃下加標(biāo)記緩沖液120 min，封閉液封閉、稀釋?zhuān)珼AB顯色，蒸餾水沖洗，脫水、透明、封固，鏡下觀察。

1.2.9Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取大鼠腦海馬組織50 mg提取總蛋白，Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2凋亡蛋白、IL-6、TGF-β1炎癥因子蛋白、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，行10%SDS-PAGE 凝膠電泳，加樣量為50 μg，轉(zhuǎn)膜，加入稀釋的一抗4℃孵育24 h，加入二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1UCBMSCs鑒定 接種72 h后出現(xiàn)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)多呈梭形，接種7 d后可見(jiàn)逐漸增多的梭形細(xì)胞(圖1A、B)；第3代UCBMSCs呈典型的旋渦狀排列，單個(gè)細(xì)胞呈紡錘形(圖1C)，其高表達(dá)CD105、CD90表面標(biāo)記物，低表達(dá)CD30表面標(biāo)記物(圖2)。油紅O染色顯示UCBMSCs可分化為脂肪細(xì)胞(圖3A)，可見(jiàn)大小不等的紅色脂滴，茜素紅染色顯示UCBMSCs可分化為成骨細(xì)胞(圖3B)，可見(jiàn)大小不規(guī)則的紅色礦化結(jié)節(jié)。

2.2UCBMSCs促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù) 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能正常，不同時(shí)段的神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分。UCBMSCs組與損傷組術(shù)后1 d的神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UCBMSCs組術(shù)后3、7、14 d的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于損傷組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 UCBMSCs的細(xì)胞形態(tài)特征(×100)Fig.1 Morphological characteristics of UCBMSCs(×100)

圖2 第3代UCBMSCs的表面標(biāo)記物表達(dá)Fig.2 Expression of surface markers in generation 3 UC-BMSCs

圖3 UCBMSCs的成脂與成骨誘導(dǎo)分化(×100)Fig.3 Adipogenic and osteogenic differentiation of UCB-MSCs(×100)

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)段神經(jīng)功能缺損評(píng)分

2.3UCBMSCs改善炎癥因子分泌 術(shù)后1、3、7、14 d，損傷組IL-6水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)，TGF-β1水平低于假手術(shù)組(P<0.05)；術(shù)后3、7、14 d， UCBMSCs組IL-6水平低于損傷組(P<0.05)，TGF-β1水平高于損傷組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4UCBMSCs的神經(jīng)保護(hù)作用 假手術(shù)組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列規(guī)則緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)可見(jiàn)豐富的尼氏小體；損傷組海馬區(qū)錐體細(xì)胞缺失，排列混亂，細(xì)胞輪廓不清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體縮??；與損傷組相比，UCBMSCs組海馬區(qū)椎體細(xì)胞明顯增加，排列規(guī)則有序，細(xì)胞輪廓較清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體變大，見(jiàn)圖4。

2.5移植UCBMSCs的存活與分化 術(shù)后14 d，在大鼠腦海馬組織內(nèi)可見(jiàn)MAB1281標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)也可見(jiàn)NeuN標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞，兩者有重疊，說(shuō)明移植的UCBMSCs在海馬區(qū)存活，并部分分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，見(jiàn)圖5。DAPI 染色的為腦組織內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞，MAB1281標(biāo)記的為移植的UCBMSCs，NeuN標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞為移植干細(xì)胞分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞。

2.6UCBMSCs調(diào)節(jié)p-Akt蛋白表達(dá) 4組Akt蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。損傷組p-Akt蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)，UCBMSCs組、抑制劑組p-Akt蛋白表達(dá)高于損傷組(P<0.05)，UCBMSCs組p-Akt蛋白表達(dá)高于抑制劑組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

2.7UCBMSCs通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 Tunel染色可見(jiàn)假手術(shù)組僅有少量凋亡神經(jīng)元細(xì)胞，凋亡率為(6.19±1.23)%；與假手術(shù)組相比，損傷組可見(jiàn)大量凋亡神經(jīng)元細(xì)胞，凋亡率為(56.79±3.41)%；UCBMSCs組也可見(jiàn)較多凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞，但數(shù)量明顯少于損傷組，凋亡率為(26.38±2.17)%；抑制劑組凋亡神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量介于損傷組與UCBMSCs組之間，細(xì)胞凋亡率為(40.13±2.97)%，4組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

2.8UCBMSCs通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)凋亡蛋白、炎癥因子蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，損傷組Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；與損傷組相比，UCBMSCs組、抑制劑組Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；UCBMSCs組與抑制劑組Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，損傷組IL-6蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，TGF-β1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與損傷組相比，UCBMSCs組、抑制劑組IL-6蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，TGF-β1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；UCBMSCs組與抑制劑組IL-6蛋白、TGF-β1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

表2 各組大鼠血清炎癥因子濃度

圖4 各組大鼠腦海馬區(qū)尼氏染色(×100)Fig.4 Nissl staining in hippocampus of rats in each group(×100)Note:A.Sham;B.Injury；C.UCBMSCs.

圖5 移植的UCBMSCs在大鼠腦海馬區(qū)的存活與分化Fig.5 Survival and differentiation of UCBMSCs transplanted in rat hippocampus

圖6 各組Akt、p-Akt蛋白表達(dá)Fig.6 Expressions of Akt and p-Akt in each groupNote:Compared with sham，*.P<0.05；compared with injury，#.P<0.05；compared with UCBMSCs，△.P<0.05.

圖7 Tunel染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡(×400)Fig.7 Tunel staining of apoptotic cells in each group(×400)Note:A.Sham;B.Injury；C.UCBMSCs;D.Inhibitor.

圖8 各組凋亡蛋白與炎癥因子蛋白表達(dá)Fig.8 Expressions of apoptotic protein and inflammatory factor in each groupNote:Compared with sham group，*.P<0.05;compared with injury group，#.P<0.05;compared with UCBMSCs,△.P<0.05.

3 討論

炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，腦組織缺血后，多種炎癥介質(zhì)破壞神經(jīng)血管單元，其中IL-6是腦損傷后出現(xiàn)最早的炎癥因子，臨床將其作為早期評(píng)估缺血性腦卒中損傷程度的重要指標(biāo)[11-12]。TGF-β1參與缺血性腦卒中發(fā)展過(guò)程，可作為缺血性腦損傷預(yù)后獨(dú)立保護(hù)因子，對(duì)判斷患者預(yù)后具有一定價(jià)值。本研究選擇炎癥因子IL-6、TGF-β1進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL-6與TGF-β1參與缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展，與既往研究結(jié)果一致[13]。UCBMSCs組術(shù)后3～14 d，IL-6水平明顯低于損傷組，TGF-β1水平明顯高于損傷組，神經(jīng)功能損傷評(píng)分低于損傷組，說(shuō)明UCBMSCs可通過(guò)降低IL-6水平、提升TGF-β1水平改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能。課題組推測(cè)UCBMSCs可能通過(guò)以下途徑調(diào)節(jié)炎癥因子水平：腦缺血損傷后，腦組織內(nèi)免疫細(xì)胞(如小膠質(zhì)細(xì)胞)活化及外周血免疫細(xì)胞浸潤(rùn)引發(fā)炎癥反應(yīng)，而UCBMSCs分泌的因子作用于巨噬細(xì)胞，使其由M1向M2型轉(zhuǎn)化，干預(yù)免疫分泌的細(xì)胞因子圖譜，同時(shí)抑制和極化膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)與抗炎作用[14]。但UCBMSCs自身還是其分化后分泌的物質(zhì)參與免疫調(diào)節(jié)，還是二者共同發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。

尼氏染色顯示，損傷組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞缺失，排列混亂，細(xì)胞輪廓不清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體縮??；相比于損傷組，UCBMSCs組大鼠海馬區(qū)椎體細(xì)胞明顯增加，排列規(guī)則有序，細(xì)胞輪廓較清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體變大，說(shuō)明UCBMSCs可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

干細(xì)胞移植主要有手術(shù)(腦內(nèi)立體定向、腰椎穿刺、介入選擇性頸內(nèi)動(dòng)脈注射)與非手術(shù)(靜脈注射)2種途徑，各注射方式都有其優(yōu)缺點(diǎn)，臨床中應(yīng)根據(jù)患者實(shí)際情況進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇股靜脈注射途徑，簡(jiǎn)單易行，無(wú)醫(yī)療條件及醫(yī)療水平限制，且不會(huì)對(duì)患者造成損傷，治療費(fèi)用較低。同時(shí)，由于腦缺血后各種致腦損傷的炎癥因子被釋放與激活，嚴(yán)重破壞血腦屏障，經(jīng)血管移植的干細(xì)胞較易進(jìn)入腦損傷部位。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光染色顯示，經(jīng)股靜脈移植的UCBMSCs可在腦組織中存活，并部分分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，但最佳移植細(xì)胞數(shù)還有待進(jìn)一步研究。

PI3K/Akt信號(hào)通路是經(jīng)典的抗凋亡通路，其作用途徑可分為Akt/Caspase途徑、Akt/GSK-3β途徑、Akt/叉頭途徑、Akt/Bcl-2途徑、NF-kB途徑與eNOS途徑，研究證明PI3K/Akt信號(hào)通路與缺血性腦卒中關(guān)系密切[15]。涂獻(xiàn)坤等[16]研究顯示大鼠腦組織缺血24 h后，缺血腦組織p-Akt蛋白表達(dá)上調(diào)，PI3K/Akt信號(hào)通路確實(shí)參與缺血性腦損傷發(fā)病。本研究假設(shè)PI3K/Akt信號(hào)通路參與UCBMSCs的神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果顯示缺血性腦損傷發(fā)生后，大鼠腦組織海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)上調(diào)，腦組織IL-6蛋白、Bax蛋白表達(dá)升高，而TGF-β1蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，同時(shí)p-Akt蛋白表達(dá)上升；UCBMSCs移植后，缺血性腦損傷大鼠腦海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)減少，腦組織IL-6蛋白、Bax蛋白表達(dá)降低、TGF-β1蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)升高，同時(shí)p-Akt蛋白表達(dá)進(jìn)一步上升，說(shuō)明PI3K/Akt信號(hào)通路可能在UCBMSCs的抗炎與神經(jīng)保護(hù)作用中具有重要調(diào)節(jié)作用。UCBMSCs的抗炎與神經(jīng)保護(hù)作用可被Akt1/2/3抗體抑制劑削弱，進(jìn)一步說(shuō)明UCBMSCs通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗炎與神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

綜上，本研究證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路在UCBMSCs減輕缺血性腦損傷和炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，但UCBMSCs的神經(jīng)保護(hù)作用是否還有其他通路參與、其具體作用機(jī)制如何仍有待進(jìn)一步研究。