硫噴妥鈉通過(guò)MyD88/NF-κB信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞在脂多糖誘導(dǎo)下的免疫反應(yīng)

陳 剛 何愛(ài)萍

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，西安 710077)

硫噴妥鈉作為臨床上比較常用的一種經(jīng)靜脈使用的短效巴比妥類(lèi)麻醉藥，具有較高的脂溶性，靜脈注射后極易通過(guò)血腦屏障，并作用于腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸突觸，增加其對(duì)遞質(zhì)的敏感性，同時(shí)又能阻斷興奮性神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸的作用，從而降低大腦皮層的興奮性，抑制維持大腦興奮和覺(jué)醒的上行網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)激活系統(tǒng)，降低神經(jīng)生理和腦功能活動(dòng)，并最終產(chǎn)生全身麻醉作用[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉除用于手術(shù)麻醉誘導(dǎo)與維持外，還可對(duì)免疫功能產(chǎn)生影響。如王軍等[2]在通過(guò)對(duì)比經(jīng)硫噴妥鈉與異丙酚麻醉的胃癌患者發(fā)現(xiàn)，使用硫噴妥鈉可明顯抑制胃癌患者體內(nèi)炎癥因子TNF-α與IL-6濃度。國(guó)外學(xué)者通過(guò)對(duì)比不同麻醉藥刺激外周單核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉能夠激活體內(nèi)免疫抑制從而維持術(shù)后免疫平衡狀態(tài)[3]。LOOP團(tuán)隊(duì)和ICHIYAMA團(tuán)隊(duì)[4-5]均發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉可以通過(guò)抑制NF-κB的活性起到免疫抑制的作用。然而，硫噴妥鈉與NF-κB之間具體的作用機(jī)制尚不明確。

髓樣分化因子(myeloiddifferentiation factor 88,MyD88)是一種分子質(zhì)量為34 kD的蛋白質(zhì)，為NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用分子[6]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境中的不良刺激后，通過(guò)一系列反應(yīng)能夠釋放穩(wěn)定存在于細(xì)胞骨架中的MyD88，使之激活并作為啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)的靶分子進(jìn)入胞質(zhì)，而處于炎癥反應(yīng)中樞地位的NF-κB隨即被活化而轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，與相應(yīng)靶基因中的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)免疫反應(yīng)的應(yīng)答[7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者鄧娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)靜藥右美托咪定可明顯緩解脂多糖刺激下的小鼠肺組織中異常升高的MyD88與NF-κB蛋白含量。而麻醉藥丙泊酚可能通過(guò)抑制MyD88的表達(dá)下調(diào)多糖所誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞ROS的釋放。以上文獻(xiàn)提示MyD88在不同麻醉鎮(zhèn)痛藥所引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，然而，目前尚無(wú)關(guān)于MyD88在硫噴妥鈉所引起的免疫抑制中作用的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在研究硫噴妥鈉對(duì)巨噬細(xì)胞在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)下免疫反應(yīng)，并初步探討其相關(guān)作用機(jī)制，以期為硫噴妥鈉對(duì)圍手術(shù)期患者的免疫功能影響提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人外周單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物研究所)；RPMI1640(Hyclone公司，美國(guó))；胎牛血清(FBS)、雙抗青鏈霉素(Gibco公司，美國(guó))；佛波酯(PMA)、脂多糖(LPS)(Sigma公司，美國(guó))；TRIzol (Invitrogen公司，美國(guó))；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，日本)；HRP標(biāo)記二抗(北京中杉)；IL-6、TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒(R&D公司，美國(guó))； si-MyD88及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組(上海瑞賽生物)； CD80-Percp(Biolegend公司，美國(guó))RT-PCR引物合成(上海生工)；p65、p-p65(Abcam,美國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分化及巨噬細(xì)胞鑒定 THP-1為懸浮細(xì)胞，常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后接種于含1%雙抗、10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，傳代至3代后選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，并接種至24孔板，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100 ng/ml的PMA孵育48 h，以誘導(dǎo)懸浮的THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，去除細(xì)胞上清液，并用PBS輕輕沖洗3次，以去除未分化細(xì)胞及殘存PMA。重新加入含1%雙抗、10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基并通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取生長(zhǎng)融合至50%的THP-1巨噬細(xì)胞，用Opti-MEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個(gè)/ml，并將si-MyD88及陰性對(duì)照序列si-NC分別轉(zhuǎn)入THP-1巨噬細(xì)胞中，根據(jù)Lipofect-amine3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并將轉(zhuǎn)染后的THP-1巨噬細(xì)胞記為si-MyD88、si-NC。si-MyD88 轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染si-MyD88的細(xì)胞中可見(jiàn)綠色熒光蛋白，表明轉(zhuǎn)染成功。將細(xì)胞分為T(mén)HP-1組，即無(wú)任何處理的THP-1巨噬細(xì)胞；抑制組，即si-MyD88組細(xì)胞；抑制組對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組，即si-NC組細(xì)胞。

1.2.3細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1巨噬細(xì)胞并用含硫噴妥鈉(0、7.5、15、30 μmol/L)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用1 000 ng/ml的LPS刺激細(xì)胞24 h。PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml,取2 ml細(xì)胞懸液至流式管中，3 000 r/min離心5 min，棄上清后，加入100 μl的PBS重懸細(xì)胞后，加入抗人CD80-FITC抗體，4℃避光孵育30 min后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4ELISA 按1.2.3處理細(xì)胞并分組后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，3 000 r/min離心5 min，去沉淀，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞中IL-6、TNF-α、IL-10的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5RT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的si-MyD88組及對(duì)應(yīng)的陰性細(xì)胞組細(xì)胞，按照TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)純度與質(zhì)量后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。在按照RT-PCR配置體系加樣后，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)實(shí)時(shí)定量。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性 6 s，60℃退火，延伸37 s，40個(gè)循環(huán)。RT-PCR的引物設(shè)計(jì)如下：MyD88F：5′-CGATAGTTGGCACGTCGTGG-3′,R：5′-GTAGTCGAGTGCGCATGACA-3′;U6F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R：5′-AACGCTTCACGAATTTG-CGT-3′。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的si-MyD88組及對(duì)應(yīng)的陰性細(xì)胞組細(xì)胞，置于冰上，加入RIPA裂解液，裂解30 min，12 000 g/min，4℃離心15 min后取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，按1∶4比例向上清液中加入蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。SDS分離膠及濃縮膠配置完成后，加入相應(yīng)體積的蛋白樣品及蛋白marker進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白條帶。待電泳結(jié)束后，300 mA電流90 min 進(jìn)行轉(zhuǎn)模，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后，TBST洗膜3次，每次5 min。加入稀釋后的NF-κB p65(1∶500)、p-NF-κB p65(1∶850)、MyD88(1∶800)一抗，于4℃搖床孵育過(guò)夜。次日TBST溶液清洗3次，5 min/次，置于HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫振蕩1 h，再次 TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin的比值作為其相對(duì)含量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果

2.1THP-1巨噬細(xì)胞的形態(tài)鑒定 PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化48 h后，懸浮生長(zhǎng)的THP-1單核細(xì)胞轉(zhuǎn)為貼壁的巨噬細(xì)胞，并從胞體伸出偽足，見(jiàn)圖1。

2.2硫噴妥鈉抑制THP-1巨噬細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下的免疫反應(yīng) 流式細(xì)胞術(shù)及ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，單獨(dú)使用硫噴妥鈉處理THP-巨噬細(xì)胞時(shí)，對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞表面CD80及炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10的分泌影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)THP-1巨噬細(xì)胞預(yù)先被不同濃度的硫噴妥鈉預(yù)處理后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，硫噴妥鈉能夠明顯降低THP-1巨噬細(xì)胞表面CD80的表達(dá)(P<0.05)，且具有濃度依賴性；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，硫噴妥鈉能夠明顯降低THP-1巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10的分泌，且以高濃度的硫噴妥鈉(30 μmol/L)作用最為顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3硫噴妥鈉對(duì) LPS 誘導(dǎo)下的 THP-1 巨噬細(xì)胞中MyD88的表達(dá)影響 鑒于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本部分實(shí)驗(yàn)中選取30 μmol/L的硫噴妥鈉對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硫噴妥鈉能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)下的THP-1巨噬細(xì)胞中MyD88 mRNA表達(dá)(P<0.05)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硫噴妥鈉能夠明顯下調(diào)LPS誘導(dǎo)下的THP-1巨噬細(xì)胞中MyD88蛋白表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖1 THP-1細(xì)胞形態(tài)變化(×200)Fig.1 Morphological changes of THP-1 cells(×200)Note:A.THP-1 monocytes;B.Differentiated THP-1 macrophages.

圖2 硫噴妥鈉抑制THP-1巨噬細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下的免疫反應(yīng)Fig.2 Thiopental sodium inhibits LPS-induced immune response of THP-1 macrophagesNote:A～B.Flow chart and analysis of effect of thiopental sodium on the expression of CD80 on THP-1 macrophages induced by LPS;C～E stands for effect of thiopental on secretion of IL-6,TNF-α and IL-10 by THP-1 macrophages induced by LPS.*.P<0.05 vs LPS(+) thiopental sodium(0 μmol/L).

圖3 硫噴妥鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)下的THP-1巨噬細(xì)胞中MyD88的表達(dá)影響Fig.3 Effect of thiopental sodium on MyD88 expression of LPS-induced THP-1 macrophagesNote:A.Effect of thiopental sodium on expression of MyD88 in LPS-induced THP-1 macrophages;B.Effect of thiopental sodium on expression of MyD88 in LPS-induced THP-1 macrophages.*.P<0.05,LPS(+) thiopental sodium(-) vs LPS(+)thiopental sodium(+).

圖4 THP-1巨噬細(xì)胞中MyD88的表達(dá)

2.4THP-1巨噬細(xì)胞中MyD88的表達(dá) 與THP-1組相比，si-MyD88組細(xì)胞中MyD88 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，si-NC細(xì)胞中MyD88變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與THP-1組相比，si-MyD88組細(xì)胞中MyD88 蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，si-NC細(xì)胞變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖5 MyD88抑制THP-1巨噬細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下的炎癥反應(yīng)Fig.5 MyD88 inhibits LPS-induced inflammatory response of THP-1 macrophagesNote:A.MyD88 affects expression of CD80 on THP-1 macrophages induced by LPS;B～D stands for MyD88 affects secretion of IL-6,TNF-α and IL-10 by THP-1 macrophages induced by LPS.*.P<0.05 vs THP-1 group.

圖6 硫噴妥鈉抑制LPS誘導(dǎo)下的THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路磷酸化Fig.6 Thiopental sodium inhibits phosphorylation of NF-κB signaling pathway in LPS-induced THP-1 macrophagesNote:*.P<0.05,LPS(+) thiopental sodium(-) vs LPS(+)thiopental sodium(+).

2.5MyD88抑制THP-1巨噬細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下的免疫反應(yīng) 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與THP-1組相比，si-MyD88組細(xì)胞表面CD80顯著下降(P<0.05)，si-NC組細(xì)胞變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與THP-1組相比，si-MyD88組細(xì)胞的IL-6、TNF-α、IL-10水平顯著降低(P<0.05)，si-NC細(xì)胞變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

2.6硫噴妥鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)下的THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硫噴妥鈉能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)下的THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路中p65蛋白的磷酸化(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

3 討論

硫噴妥鈉作為速效巴比妥類(lèi)麻醉藥，因其具有較高的脂溶性，極易通過(guò)血腦屏障，且能夠降低腦組織耗氧量并促進(jìn)腦血管收縮，減少腦血流量，降低顱內(nèi)壓等作用，因此常被用作顱腦手術(shù)、腦復(fù)蘇等必備藥品[9]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到，圍手術(shù)期患者免疫功能紊亂可誘發(fā)一系列術(shù)后并發(fā)癥，如術(shù)后傷口愈合不良、癌癥患者腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移等[1]。因此選擇合適的麻醉方法和藥品對(duì)術(shù)后患者的恢復(fù)及獲得良好預(yù)后具有重要意義。

巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞具有多種功能，其即可以作為吞噬細(xì)胞以清除病原體及細(xì)胞碎片，又可以作為分泌細(xì)胞來(lái)分泌多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等，故其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[10]。但由于外周血中巨噬細(xì)胞數(shù)量較少，且分離過(guò)程復(fù)雜等原因，因此常利用PMA誘導(dǎo)下THP-1單核細(xì)胞系分化為巨噬細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中，利用此方法成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)。LPS是革蘭性陰性菌外膜的主要組成部分，在生物體內(nèi)可引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，常被用來(lái)刺激巨噬細(xì)胞而形成感染和炎癥模型[13]。CD80多表達(dá)于各種免疫細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等活化的APC表面，作為免疫系統(tǒng)激活的共同刺激信號(hào)參與調(diào)節(jié)機(jī)體各種免疫應(yīng)答。在機(jī)體中，吞噬細(xì)胞在受到不良刺激活化后可分泌IL-6、TNF-α、IL-10等多種炎癥介質(zhì)，有研究提示，在炎癥損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放大量的IL-6、TNF-α、IL-10等炎癥細(xì)胞因子入血，形成神經(jīng)毒性因子并彼此之間相互作用，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致免疫功能紊亂[14]。

在機(jī)體內(nèi)，活化炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路眾多，其中最重要的通路為T(mén)LR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路[15]。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)為固有天然免疫受體，此類(lèi)受體廣泛分布于生物體中，且主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等表面，可對(duì)病原微生物的相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合并引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。TLR4是真核生物體內(nèi)介導(dǎo)LPS應(yīng)答的主要受體[17]。研究發(fā)現(xiàn)，在機(jī)體受到LPS刺激時(shí)，TLR4位于胞內(nèi)的TIR區(qū)域與MyD88的羧基端相結(jié)合，可進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路，從而促進(jìn)各種炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)特異性敲除MyD88基因后，在小鼠腹腔內(nèi)注射大劑量LPS時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-10變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而正常對(duì)照組小鼠在4天內(nèi)均死于嚴(yán)重炎癥反應(yīng)[19]。提示MyD88在LPS引起的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。RelA(p65)屬于NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵作用蛋白，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)的作用。在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，IL-6、TNF-α、IL-10等炎癥介質(zhì)及LPS等多種因素可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺組織中p65蛋白磷酸化，從而激活NF-κB信號(hào)通路，又可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，從而加劇炎癥反應(yīng)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硫噴妥鈉能夠明顯抑制LPS對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞中MyD88的mRNA及蛋白的表達(dá)。在THP-1巨噬細(xì)胞，硫噴妥鈉可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中MyD88的表達(dá)以抑制細(xì)胞對(duì)LPS的免疫應(yīng)答。并且硫噴妥鈉能夠抑制LPS誘導(dǎo)下的THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的磷酸化，以抑制信號(hào)通路活化。

綜上所述，硫噴妥鈉能夠抑制巨噬細(xì)胞在LPS刺激誘導(dǎo)下的免疫反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞中MyD88/NF-κB信號(hào)通路激活水平有關(guān)，本研究明確硫噴妥鈉在圍手術(shù)期患者免疫功能中的作用，然而，對(duì)于硫噴妥鈉在體內(nèi)免疫系統(tǒng)中的其他作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。