miR-448靶向SIRT1對血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡和運動能力的調(diào)節(jié)作用①

朱彥彬 李 立 王賢芝 仲 偉 張富釗

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血管外科，南充 637000)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)是動脈中膜的重要組成部分，是執(zhí)行血管收縮功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。臨床研究表明，VSMCs異常增殖與多種心血管疾病(動脈粥樣硬化、冠心病和冠脈支架內(nèi)再狹窄等)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2]。研究調(diào)節(jié)VSMCs細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵因子對心血管疾病治療具有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(silencing information regulatory protein 1，SIRT1)是Sirtuin家族成員，可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥和自噬等生理過程，對動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷等具有預(yù)防保護作用[3]。研究顯示，SIRT1可抑制VSMCs增殖及血管炎癥反應(yīng)，但其上游調(diào)節(jié)機制尚未明確[4-5]。miR-448屬于miRNA家族，可與靶mRNA的3′UTR互補結(jié)合抑制多種蛋白翻譯，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程[6]。miR-448可調(diào)節(jié)SIRT1表達，參與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展，但其對VSMCs的作用及機制報道較少[7]。本研究分析miR-448和SIRT1的靶向關(guān)系及其對VSMCs細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用，為心血管疾病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠20只，體重250～280 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2017-0022，飼養(yǎng)于我院動物中心實驗室，每12 h更換光照條件，保持室溫恒定為25℃，自由攝食與飲水。

1.1.2儀器 FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.3試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛世爾)；熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)；EDU試劑盒(廣東銳博生物科技有限公司)；MTT檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Transwell小室、Matrigel基底膜(美國BD公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑(日本TaKaRa公司)；抗GAPDH抗體、抗α-SMA抗體、抗Ki67抗體、抗PCNA抗體、抗Caspase-3抗體、抗Caspase-9抗體、抗MMP-2抗體及抗MMP-9抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1造模 SD大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和模型組，每組10只。參考文獻[8]建立頸動脈損傷模型：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(6 ml/kg)麻醉，剃除頸部皮毛，75%酒精局部消毒，分離皮下組織和肌肉，暴露頸內(nèi)動脈、頸外動脈、頸總動脈，頸外動脈遠(yuǎn)心端打死結(jié)，動脈夾臨時結(jié)扎頸內(nèi)動脈和頸總動脈近心端，顯微剪在頸外動脈剪1個小口，沿頸外動脈將2.0 F球囊送至頸總動脈，注射生理鹽水充盈球囊，反復(fù)抽拉3次后放氣，撤出球囊，待頸動脈血流恢復(fù)后依次縫合，對照組僅暴露頸動脈后即縫合傷口。術(shù)后14 d腹腔麻醉處死大鼠，分離頸全部總動脈。

1.2.2大鼠頸動脈組織VSMCs細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定 將頸總動脈放入D-Hanks液中洗清殘血，血管放入2 mg/ml Ⅱ 型膠原酶和高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(1∶1)中，37℃溫浴15 min，剝?nèi)パ鼙砻娼钅ず屠w維層，置于含1%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，37℃孵育過夜，分別加入1 ml Ⅱ型膠原酶(2 mg/ml)和彈力蛋白酶(0.25 mg/ml)于6孔板，剪碎，37℃孵育1 h，槍頭吹打后離心，重懸，細(xì)胞生長至 80%融合(7～10 d)傳代。采用α-SMA單克隆抗體進行免疫熒光鑒定，取培養(yǎng)到第2代的對數(shù)期細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，加入1 ml 4%多聚甲醛固定20 min，加入 0.25 % Triton X-100 室溫透膜 1 h，加入含 10%山羊血清的封閉液室溫封閉1 h，加入羊抗鼠α-SMA 一抗(1∶ 200)4℃孵育過夜，加入Alex488 兔抗羊二抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，加入DAPI 染核，室溫避光10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3RT-PCR、Western blot檢測大鼠頸動脈組織VSMCs miR-448和SIRT1表達 取各組大鼠VSMCs，Trizol法提取組織總RNA，RT-PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，參考文獻[9-10]設(shè)計引物、反應(yīng)體系及條件。采用細(xì)胞裂解液嚴(yán)格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，將50 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入一抗4℃孵育過夜，加二抗37℃孵育2 h，ECL顯色。Photoshop軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4miR-448和SIRT1靶向關(guān)系研究 將體外分離培養(yǎng)的正常大鼠VSMCs接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后分別轉(zhuǎn)染miR-448 mimic和miR-448 inhibitor。RT-PCR測定各VSMCs中miR-448表達。Western blot檢測SIRT1蛋白表達。熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究miR-448和SIRT1靶向關(guān)系，miRNA靶點預(yù)測軟件提示，miR-448的可能結(jié)合位點為SIRT1 mRNA的3′UTR 位點906～913，體外合成含該位點的DNA片段(wt)及含該位點突變體(mut)的DNA片段，亞克隆至雙熒光素酶啟動子載體。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于miR-448組和miR-448 inhibitor組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將體外分離培養(yǎng)的正常大鼠VSMCs分為miR-448組、miR-SIRT1組、SIRT1組和對照組。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-448 mimic，轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞，將miR-448 mimic轉(zhuǎn)染于miR-488組和miR-SIRT1組細(xì)胞；將SIRT1構(gòu)建至pc-DNA 3.1載體過表達后轉(zhuǎn)染至miR-SIRT1組和SIRT1組細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染試劑操作步驟進行轉(zhuǎn)染。

1.2.6EDU染色檢測細(xì)胞的增殖 取轉(zhuǎn)染后各組VSMCs，按照EDU試劑盒說明書進行EDU染色，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，Image-pro Plus軟件計算。Western blot檢測Ki67、PCNA蛋白表達。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡 取轉(zhuǎn)染后各組VSMCs，離心管收集細(xì)胞培養(yǎng)液及胰酶消化后的細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸并計數(shù)。取5×104～1×105個/ml重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，依次加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，5 μl Annexin V-FITC輕輕搖勻，10 μl Propidium Iodide染色液混勻。室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測。Western blot檢測Caspase-3和Caspase-9蛋白表達。

1.2.8Transwell檢測細(xì)胞侵襲 取100 μl稀釋好的基質(zhì)膠均勻覆蓋于Transwell小室底部。取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，0.2%胰蛋白酶消化，以含1%小牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/ml。取100 μl 稀釋好的細(xì)胞懸液加于上室，下室為500 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，取出小室，按照Hemacolor Kit說明書固定、染色，下室面表面細(xì)胞為侵襲細(xì)胞，顯微鏡下拍照、計數(shù)，共計數(shù)5個視野，取平均值。實驗設(shè)置3個平行小室，重復(fù)3次，以穿膜的腫瘤細(xì)胞數(shù)評價其侵襲能力。

1.2.9劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 取轉(zhuǎn)染后各組VSMCs接種于96孔板，待細(xì)胞長滿單層棄培養(yǎng)基，滅菌移液槍頭在皿底劃一直線，洗滌3次，盡量清洗掉被劃下的細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞生長情況，根據(jù)劃痕寬度計算細(xì)胞遷移率。Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠動脈損傷組織VSMCs分離鑒定 正常組織和動脈損傷組織VSMCs中均可見α-SMA陽性信號，表明所分離細(xì)胞為VMSCs。見圖1。

2.2miR-448和SIRT1在動脈損傷組織VSMCs中的表達 與對照組相比，動脈損傷組織VSMCs中miR-448表達明顯上調(diào)(P<0.05)，SIRT1表達明顯下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

2.3miR-448靶向抑制SIRT1表達 與對照組相比，miR-448組miR-448表達明顯上調(diào)(P<0.05)，SIRT1表達明顯下調(diào)(P<0.05)，miR-448 inhibitor組miR-448表達明顯下調(diào)(P<0.05)，SIRT1表達明顯上調(diào)(P<0.05)。熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型熒光素酶質(zhì)粒和miR-448，熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，表明miR-448可靶向負(fù)調(diào)控SIRT1，見圖3。

2.4miR-448靶向抑制SIRT1促進VSMCs增殖 EDU細(xì)胞增殖實驗顯示，與對照組相比，miR-448組細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)，SIRT1組細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。Western blot顯示，與對照組相比，miR-448組Ki67和PCNA蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)，SIRT1組Ki67和PCNA蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組Ki67和PCNA蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖4。

2.5miR-448靶向抑制SIRT1抑制VSMCs凋亡 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-448組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，SIRT1組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)。Western blot顯示，與對照組相比，miR-448組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)，SIRT1組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

圖1 各組大鼠動脈損傷組織中VSMCs分離鑒定Fig.1 Isolation and identification of VSMCs in artery injury tissues of rats

圖2 miR-448和SIRT1在正常組織與動脈損傷組織VSMCs中的表達Fig.2 Expression levels of miR-448 and SIRT1 in VSMCs of normal tissues and arterial injury tissuesNote:Compared with Control,*.P<0.05.

圖3 miR-448對SIRT1 表達的靶向調(diào)控作用Fig.3 Effect of miR-448 on targeting expression of SIRT1Note:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1 wt,#.P<0.05.

圖4 miR-448靶向抑制SIRT1對VSMCs增殖的影響Fig.4 Effect of miR-448 targeting inhibiting SIRT1 on proliferation of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

圖5 miR-448靶向抑制SIRT1對VSMCs凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-448 targeting inhibiting SIRT1 on apoptosis of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

圖6 miR-448靶向抑制SIRT1對VSMCs細(xì)胞侵襲和遷移的影響Fig.6 Effect of miR-448 targeting SIRT1 on inhibit invasion and migration of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

2.6miR-448靶向抑制SIRT1促進VSMCs侵襲和遷移 與對照組相比，miR-448組細(xì)胞侵襲率和遷移率明顯升高(P<0.05)，SIRT1組細(xì)胞侵襲率和遷移率明顯下降(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組細(xì)胞侵襲率和遷移率升高(P<0.05)。Western blot顯示，與對照組相比，miR-448組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)，SIRT1組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)；與SIRT1組相比，miR-SIRT1組MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖6。

3 討論

miR-448屬于miRNAs家族，參與冠狀動脈粥樣硬化、前列腺癌、乳腺癌等多種疾病的發(fā)生。LI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-448可促進VSMCs增殖和遷移，在多種心血管疾病(冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓等)中具有重要作用，但作用機制尚未明確。本研究建立大鼠頸動脈損傷模型，分析miR-448作用于VSMCs的機制。本研究中，動脈損傷組織VSMCs中miR-448表達明顯上調(diào)，SIRT1表達明顯下調(diào)，且經(jīng)熒光素酶活性實驗證實miR-448可靶向負(fù)調(diào)控SIRT1表達，提示miR-448可能通過靶向負(fù)調(diào)控SIRT1表達調(diào)控VSMCs生物學(xué)行為，參與動脈組織損傷的病理過程。SIRT1作為Sirtuins家族成員，參與多種細(xì)胞過程，如能量代謝、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激等[12]。研究表明，SIRT1可調(diào)節(jié)VSMCs功能紊亂，在血管的生長發(fā)育中具有重要作用[13]。提示miR-448可通過靶向負(fù)調(diào)控SIRT1表達調(diào)節(jié)VSMCs功能，導(dǎo)致動脈組織損傷。

VSMCs異常增殖是高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-448可靶向抑制SIRT1表達上調(diào)Ki67和PCNA蛋白表達，促進VSMCs細(xì)胞增殖。Ki67和PCNA為細(xì)胞增殖蛋白，是目前反映腫瘤細(xì)胞增殖活性和增殖速率最可靠的指標(biāo)，與多種惡性腫瘤的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[15]。提示miR-448可通過抑制SIRT1表達上調(diào)細(xì)胞增殖蛋白表達，促進VSMCs增殖。WANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可抑制損傷的VSMCs增殖，促進其凋亡，與本研究結(jié)果基本相符，提示miR-448可通過靶向抑制SIRT1表達。促進VSMCs增殖，增加高血壓、冠心病等心血管疾病發(fā)生風(fēng)險。本研究中，miR-448可靶向抑制SIRT1表達，下調(diào)Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達，抑制細(xì)胞凋亡，提示miR-448可靶向抑制SIRT1表達，抑制細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，抑制VSMCs凋亡。

臨床研究表明，損傷誘導(dǎo)的VSMCs由中膜向內(nèi)膜遷移、增殖、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)等是導(dǎo)致血管重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-448可靶向抑制SIRT1表達，上調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達，抑制VSMCs侵襲和遷移。MMP-2和MMP-9所有MMPs中分布最廣，可特異性降解Ⅳ型膠原纖維，其中MMP-9還可以釋放血管內(nèi)皮生長因子參與血管生成，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等方面具有重要作用[18-19]。KITADA等[20]研究表明，SIRT1在VSMCs侵襲和遷移中具有重要作用，與本研究結(jié)論基本相符，提示miR-448可靶向抑制SIRT1表達，上調(diào)MMP-2和MMP-9表達，促進VSMCs侵襲和遷移，增加血管重構(gòu)風(fēng)險。

綜上所述，miR-448可靶向負(fù)調(diào)控SIRT1表達，促進VSMCs增殖、侵襲和遷移，抑制其凋亡，為心血管疾病的研究和防治提供了理論基礎(chǔ)。