偽狂犬病病毒FJSW 的分離鑒定及gG 基因序列分析

傅星源 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。該病毒屬于皰疹病毒科皰疹病毒亞科，又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，對(duì)豬的危害最為嚴(yán)重[1]。 該病易與其他疫病混合感染，曾經(jīng)在世界上廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成的損失僅次于豬瘟和口蹄疫[2-3]。1990 年之后，由于偽狂犬病病毒基因缺失疫苗的使用，該病得到了控制，發(fā)病率大大降低，某些地區(qū)偽狂犬病病毒凈化取得一定成效[4-6]。 但自2011 年以來(lái)，豬偽狂犬病又有反彈趨勢(shì)，我國(guó)多個(gè)省、市、地區(qū)的豬場(chǎng)均發(fā)生了該病， 造成了一定經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。 研究表明，2012 年后流行的偽狂犬病毒株gB、gC、gD、gE 等重要糖蛋白的氨基酸序列發(fā)生了突變[8-10]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)福建某豬場(chǎng)疑似偽狂犬病死豬采集組織病料，進(jìn)行偽狂犬病病毒分離鑒定， 成功分離出偽狂犬病病毒并進(jìn)行測(cè)序。 與Genbank 中的參考毒株進(jìn)行比較， 對(duì)福建地區(qū)偽狂犬病病毒株的分子流行病學(xué)及毒株溯源進(jìn)行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 病料樣品及主要試驗(yàn)材料 病料樣品采集自福建邵武某豬場(chǎng)臨床癥狀疑似偽狂犬病發(fā)病仔豬；2×GC Buffer、Taq DNA 聚 合 酶 為TAKARA 公 司產(chǎn)品；dNTP 為上海生工產(chǎn)品； 瓊脂糖為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 檢測(cè)引物參照文獻(xiàn)[11]的引物序列進(jìn)行合成，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為347 bp；參照Genbank 中登錄的偽狂犬病病毒基因組序列 （登錄號(hào)NC006151）設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于gG 基因擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 501 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA 提取及PCR 擴(kuò)增 基因組DNA 提取按照金瑞鴻捷公司taco DNA/RNA 共同提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn) 行。 PCR 反 應(yīng) 體 系 為20 uL：2×GC Buffer 10 uL，dNTP (10 mmol/uL) 3 uL，ddH2O 3.8 uL，LA Taq DNA 聚合酶 （5 mmol/uL）0.2 uL， 上下游引物（100 uM）各0.5 uL，DNA 模板2 uL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，59 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。 PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 并將陽(yáng)性產(chǎn)物送至鉑尚生物福州測(cè)序部測(cè)序。

1.4 病毒分離鑒定 將PCR 鑒定為陽(yáng)性的腦組織勻漿液-20 ℃反復(fù)凍融3 次，12 000 r/min 離心10 min， 吸取上清通過(guò)0.22 um 濾器過(guò)濾除菌，取1 mL 接種單層Vero 細(xì)胞，37 ℃吸附1 h 后棄去接種液， 加入含有2%胎牛血清的DMEM 維持液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)正常對(duì)照組。 定時(shí)觀察細(xì)胞病變，病變達(dá)到80%時(shí)收獲病毒液，連續(xù)傳代3 次后經(jīng)PCR 進(jìn)一步鑒定。

1.5 gG 基因PCR 擴(kuò)增、 序列分析 利用gG 基因特異性引物PCR 擴(kuò)增得到目的基因片段，并送至鉑尚生物福州測(cè)序部測(cè)序。 利用生物學(xué)分析軟件DNAStar7 將分離株與GenBank 中登錄的參考毒株gG 基因的序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析，分析分離株的序列特征。

表1 序列分析用參考毒株

Bratha、Becker 和Kaplan 為歐美代表病毒株；Ea和LA 為國(guó)內(nèi)以往分離株；其余為國(guó)內(nèi)2012 年后分離株。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料樣品檢測(cè) 將疑似偽狂犬病患豬的腦組織勻漿，提取總DNA 作為模板，利用檢測(cè)引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，3 頭患豬的腦組織樣品有特異性條帶產(chǎn)生，大小與陽(yáng)性對(duì)照條帶相同，與預(yù)期結(jié)果相符，表明送檢樣品為偽狂犬病病毒陽(yáng)性（見(jiàn)圖1）。

2.2 病毒分離培養(yǎng) 陽(yáng)性腦組織液經(jīng)勻漿、過(guò)濾除菌后接種Vero 細(xì)胞，18 h 后即可觀察到細(xì)胞圓縮、聚集，24 h 后可以觀察到網(wǎng)狀CPE，48 h 后細(xì)胞出現(xiàn)脫落、空斑（見(jiàn)圖2）。 利用檢測(cè)引物對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行PCR 鑒定，能夠擴(kuò)增到特異性目的片段，而利用豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增均為陰性反應(yīng)。表明從患豬腦組織中分離出的是偽狂犬病野毒株。

圖1 患豬腦組織樣品PCR 鑒定

圖2 分離株在Vero 細(xì)胞上的病變

2.3 核苷酸序列同源性比較分析 對(duì)病變的Vero細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液提取DNA， 用偽狂犬病病毒gG 基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小一致的約1 500 bp 片段，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，F(xiàn)JSW 株的gG 基因測(cè)序片段長(zhǎng)度為1 501 bp。選擇GenBank上參考毒株的gG 基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比，F(xiàn)JSW毒株與參考毒株核苷酸同源性為98.9%～100%。 其中與國(guó)內(nèi)2012 年后分離毒株的同源性較高，為99.7%～100%，其中與JS-2012 株的同源性為100%；與歐美分離株的同源性最低，為98.9%～99.1%，其中與Kaplan 株的同源性為98.9%；與國(guó)內(nèi)以往分離株的同源性居中，其中與LA 株的同源性為99.7%，與Ea 株同源性為99.9%。 與各毒株核苷酸的同源性比較見(jiàn)表2。

表2 核苷酸序列同源性比較分析

2.4 基因進(jìn)化樹分析 基于gG 基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析顯示，F(xiàn)JSW 株與JS-2012 株處于獨(dú)立的小分支上， 形成單獨(dú)的1 個(gè)小亞群， 親緣關(guān)系最近，該結(jié)果與同源性分析結(jié)果相符；與國(guó)內(nèi)2012 年后 分 離 株HeN1、BJ/YT、TJ、XiangA 處 于 同 一 分 支中，表明FJSW 株屬于偽狂犬病病毒變異毒株；而國(guó)內(nèi)2012 年后分離株又與國(guó)內(nèi)以往分離株LA、Ea 處于同一大分支上，形成了一個(gè)中國(guó)毒株進(jìn)化群。歐洲分離株Kaplan、Bartha 與美洲分離株Becker 處于另一大分支上。

圖3 基于gG 基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析

3 討 論

自2012 年以來(lái)， 我國(guó)多地相繼暴發(fā)豬偽狂犬病，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。 研究表明，偽狂犬病病毒變異毒株某些重要的糖蛋白在多個(gè)方面發(fā)生變異，存在毒力增強(qiáng)的情況[8-10]。 gG 糖蛋白位于PRV基因組US 區(qū)域，全長(zhǎng)1 494 bp，可編碼498 個(gè)氨基酸序列，為非結(jié)構(gòu)蛋白，當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)合成該蛋白后被宿主細(xì)胞分泌到細(xì)胞外。 尚未明確gG 糖蛋白的毒力影響， 但gG 糖蛋白影響偽狂犬病病毒的吸附、擴(kuò)散、穿透作用，在病毒與宿主細(xì)胞之間的擴(kuò)散具有連接作用，可以抑制細(xì)胞遷移，對(duì)宿主細(xì)胞的凋亡有一定影響，在免疫逃避中扮演重要角色[12]。

為探明FJSW 株與參考株之間的親緣關(guān)系，本試驗(yàn)對(duì)FJSW 株的gG 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、測(cè)序，與Genbank 上已發(fā)布的參考毒株進(jìn)行同源性比對(duì)和多序列比對(duì)分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹。同源性比對(duì)結(jié)果表明，F(xiàn)JSW 株與2012 年后分離毒株在核苷酸水平上同源性較高，與國(guó)外經(jīng)典毒株同源性較低。遺傳進(jìn)化樹分析表明， 國(guó)內(nèi)毒株均同屬于同一個(gè)分支，且2012 年后分離毒株的遺傳關(guān)系更近，F(xiàn)JSW 株與2012 年后分離毒株位于同一分支，與JS-2012 親緣關(guān)系最接近； 國(guó)內(nèi)毒株與歐美分離株的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

綜上所述，F(xiàn)JSW 株與2012 年后分離的變異株親緣關(guān)系較近，屬于PRV 新流行毒株。在gG 基因上2012 年后分離株與之前的國(guó)內(nèi)外分離毒株存在不同程度的差異，但這些核苷酸水平上的差異對(duì)PRV變異株毒力以及免疫原性的影響有待進(jìn)一步研究。