牛蜱龍巖分離株的分子鑒定

楊 飛 黃翠琴

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建龍巖 364012；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院 西藏林芝 860000)

蜱系統(tǒng)分類學(xué)上屬于節(jié)肢動物門（Arthropda）、蛛形綱（Arachnida）、寄螨目（Parasitiformes）、蜱總科（Ixodoidea）。 依據(jù)蜱蟲有無殼質(zhì)化盾板(Seutum)，蜱總科又分為硬蜱科（Ixodidae）、軟蜱科（Argasidae）和納蜱科（Nuttalliellidae）3 個科，共包括13 個屬、867種蜱蟲[1]。 硬蜱具有一個起始于身體前部的堅硬盾板，雌蜱的盾板覆蓋到背部中間部位，而雄蜱的盾板覆蓋其整個背部。硬蜱的口器在背面可見，而軟蜱的口器僅從腹面可見。 蜱體長為3～12 mm，飽血的雌蜱更大。所有蜱蟲都需經(jīng)歷卵、幼蜱和若蜱階段才能發(fā)育為成蜱， 在發(fā)育過程中蜱蟲需要一個或多個宿主。 蜱在外界產(chǎn)卵，幼蜱孵出后可在外界感染宿主。硬蜱的幼蜱階段經(jīng)歷第一次蛻皮成為若蜱， 若蜱階段經(jīng)歷第二次蛻皮成為成蜱。 在兩次蛻皮期間一直寄生在宿主身上稱為一宿主蜱； 停留在宿主身上蛻化成若蜱， 飽血后脫離宿主， 在外界完成第二次蛻皮， 然后再寄生到新的宿主稱為二宿主蜱。 三宿主蜱的發(fā)育過程中，幼蜱、若蜱飽血后便會離開宿主蛻皮，然后再寄生到新的宿主上。所有的蜱蟲都需要附著宿主并經(jīng)歷幾天的吸血后才能進(jìn)行蛻皮。 一些蜱蟲在不同發(fā)育過程中傾向于寄生相同的宿主種類，另有一些蜱蟲在不同發(fā)育過程中則選擇多種宿主種類。 很多軟蜱只有在吸血時才會寄生于宿主身上。

蜱是一類常見于家畜體表的外寄生蟲， 硬蜱具有重要的獸醫(yī)學(xué)意義， 硬蜱叮咬宿主的部位多數(shù)是難以被梳理的部位， 例如宿主的頭部、 耳部以及尾部。 硬蜱可以攜帶細(xì)菌、動物原蟲、病毒以及人類的病原體。 通過叮咬吸食宿主血液， 傳播埃立克體?。‥hrlichiosis）、 無形體病 （Anaplasmosis）、 萊姆?。↙yme disease）等人畜共患病[2-4]。 此外，硬蜱還會導(dǎo)致蜱癱和蜱中毒。 因此，應(yīng)該使用鑷子去除蜱蟲，以防感染蜱內(nèi)可能含有的病原體。 即使幼蜱體長僅幾毫米，但所有發(fā)育階段的蜱均大到肉眼可見。目前發(fā)現(xiàn)的蜱種類繁多，由蜱造成的臨床癥狀和病變相似，臨床上很難區(qū)分。在獸醫(yī)實(shí)踐中，形態(tài)學(xué)鑒定是寄生蟲學(xué)研究中傳統(tǒng)的分類鑒定方法， 但是形態(tài)學(xué)對于不同發(fā)育階段的寄生蟲和相似蟲種的鑒別存在著局限性。

福建地區(qū)畜牧養(yǎng)殖業(yè)較發(fā)達(dá)， 同時該地區(qū)蜱類極為豐富。本研究采集龍巖地區(qū)牛體表寄生蜱樣本，并采用基于核糖體DNA （rDNA） 的ITS 序列進(jìn)行PCR 檢測，通過同源性比較，對龍巖地區(qū)牛體表分離的蜱類進(jìn)行分子鑒定。 ITS 序列具有種間特異性和種內(nèi)保守性，可以將蜱種類鑒定到種、亞種。

1 材 料

1.1 樣品采集與保存 采集福建龍巖地區(qū)某牛場牛蜱數(shù)只，分別置于一次性離心管中，標(biāo)明牛蜱的性別、宿主編號、采集地點(diǎn)以及采集時間。 將蟲體樣品用70%乙醇溶液固定，存放于4 ℃冰箱，用于分子鑒定。

1.2 主要試劑 基因組E.Z.N.A.TM DNA 提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；6×DNA Loading Dye、DNA Ladder Mix(100～10 000 bp)購自福州晶泰生物技術(shù)有限公司；70%乙醇溶液、DEPC 處理過的水（DEPCtreated water）、2-巰基乙醇 （2-mercaptoethanol）、滅菌去離子水、Taq Plus DNA 聚合酶、10× PCR Buffer（含Mg2+）、dNTP（10 mM）、凝膠回收試劑盒購自北京擎科新業(yè)生物有限公司；克隆連接試劑盒購自ThermoFisher 公司。

2 方 法

2.1 引物設(shè)計 引物序列由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，由北京擎科新業(yè)生物有限公司合成，引物信息見表1。

表1 ITS 基因引物序列信息

2.2 組織樣品基因組DNA 提取 選取形態(tài)完整的蟲體進(jìn)行稱量，用雙蒸水對蟲體進(jìn)行沖洗，使用研缽和杵研用約10 mL 液氮下研磨蟲體組織，盡量破碎和均勻化（Homogenization）組織樣品，然后將懸浮液倒入預(yù)冷的15 mL 聚丙烯管中。 使用前需將聚丙烯管預(yù)先在液氮中冷卻，否則會造成懸浮液劇烈沸騰，造成蟲體組織的損失。 液氮完全蒸發(fā)后， 添加Buffer GTC 試劑， 按照基因組E.Z.N.A.TM DNA 提取試劑盒提取牛蜱DNA 后置于-80 ℃保存待用。

2.3 rDNA ITS1、ITS2 基因擴(kuò)增及測序 PCR 擴(kuò)增牛蜱核糖體DNA 的ITS 基因，PCR 擴(kuò)增體系25 μL：Taq Plus 酶 （5 U/μL）0.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，dNTPs（10 mM）2 μL，MgCl2（25 mM）2 μL，上游引物（50 pmol/μL）0.5 μL，下游引物 （50 pmol/μL）0.5 μL， 模板 DNA 1 μL，ddH2O16 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃、5 min，35 個循環(huán)， 每個循環(huán)95 ℃、45 s，55 ℃、1 min，72 ℃、90 s，最后72 ℃、5 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化后， 根據(jù)克隆連接試劑盒篩選陽性克隆產(chǎn)物， 由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行基因測序。

2.4 rDNA ITS1、ITS2 基因序列分析 應(yīng)用DNAMAN 5.2.9 Demo version 獲得校正的完整序列，在NCBI 的blast 上進(jìn)行相似性搜索， 下載同源性最高的序列，應(yīng)用DNASTAR.Lasergene.v7 程序中的MegAlign 軟件與獲得的序列進(jìn)行多序列比較（multiple aligment），確定牛蜱的種屬，從ALIGN MENU 選擇Jotun Hein Method 分析序列差異。 應(yīng)用MEGA 7.0軟件，選用Neighbor joining（NJ）鄰位歸并法制作進(jìn)化樹（Phylogenetic trees），選 擇Bootstrap method 分析進(jìn)行1 000 個重復(fù)驗(yàn)證系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

3 結(jié)果與分析

3.1 牛蜱rDNA ITS 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 以提取的牛蜱基因組DNA 為模板進(jìn)行ITS1、ITS2 基因擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結(jié)果表明，1、2 為ITS1 擴(kuò)增片段，3、4 為ITS2 擴(kuò)增片段， 條帶單一明亮（見圖1），陰性對照無電泳條帶出現(xiàn)。

3.2 牛蜱rDNA ITS 基因測序結(jié)果 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后， 根據(jù)克隆連接試劑盒篩選陽性克隆產(chǎn)物， 經(jīng)北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行基因測序并拼接后，獲得長度為1 982 bp 的ITS1基因序列片段、1 414 bp 的ITS2 基因序列片段，測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中蜱ITS 基因序列完全匹配。

圖1 牛蜱ITS 基因PCR 鑒定

3.3 牛蜱rDNA ITS1、ITS2 基因序列分析 將福建省龍巖地區(qū)某牛場牛體表分離的牛蜱ITS 基因序列在NCBI 的blast 上進(jìn)行相似性搜索，比對后相似性最高的序列以確定種， 下載國內(nèi)報道主要牛蜱的ITS 基因序列等作為參考序列， 應(yīng)用MEGA 7.0 軟件，選用Neighbor joining（NJ）鄰位歸并法分別構(gòu)建ITS1、ITS2 基因序列的種系發(fā)育進(jìn)化樹。 結(jié)果顯示，所分離的牛蜱ITS1 序列與中國甘肅2016 年上傳的微 小 扇頭蜱 （Rh.microplus） 序列（JQ737125.1、JQ737124.1）相似性達(dá)99.32%，與中國湖南2019 年上傳的微小扇頭蜱HAI2、LD2、LD5、SY1 分離株（Rh.microplus） 序列（MK224531.1、MK224539.1、MK224542.1、MK224543.1） 相似性達(dá)99.16%；ITS2序列與中國河南2016 年上傳的微小扇頭蜱（Rh.microplus）序列（KX450287）相似性達(dá)100%，與南非豪登2017 年上傳的微小扇頭蜱 （Rh.microplus） 序列（KY457506.1）相似性達(dá)100%。 種系發(fā)育分析結(jié)果顯示， 龍巖地區(qū)牛體表分離的牛蜱ITS 基因序列與扇頭蜱屬（Rhipicephalus）的ITS 基因序列聚類，與革蜱屬（Dermacentor）、璃眼蜱屬（Hyalomma）處于兩個不同的分支（見圖2-圖3）。 結(jié)果表明，中國福建龍巖牛體表分離的牛蜱為微小扇頭蜱。

4 討論與結(jié)論

1）微小扇頭蜱（Rh. microplus）歸類于硬蜱科、扇頭蜱屬，呈流行性分布于世界各地[5-6]，我國華南區(qū)包括臺灣和海南全部，福建東南部，廣東、廣西中南部等地，熱帶-亞熱帶特征突出，該區(qū)域蜱類極為豐富，鐮形扇頭蜱、微小牛蜱等扇頭蜱屬為該區(qū)的廣布種[7]。微小扇頭蜱作為一宿主蜱，其主要宿主為牛。其卵在外界環(huán)境中孵化為幼蜱后便寄生于宿主上，發(fā)育期經(jīng)歷若蜱、成蜱階段，雌蜱飽血后便會離開宿主在外界環(huán)境中產(chǎn)卵，也是許多真菌、動物原蟲、病毒以及細(xì)菌的傳播媒介和貯存宿主[8]。 微小扇頭蜱的寄生不僅導(dǎo)致患病動物皮膚痛癢、 肉乳品質(zhì)和數(shù)量下降， 也可傳播多種病原， 如柯契卡弗朗斯蟲（Francaiella colchica）、牛邊緣邊蟲（Bovine Anaplasmosis）、牛雙芽巴貝斯焦蟲（Babesia bigemica）、瑟氏泰勒蟲 （Theileria sergenti） 和牛巴貝斯蟲（Babesia bovis）等威脅牛體健康的血液寄生蟲，給全世界范圍的畜牧業(yè)都造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]，而且會引起地方性人畜共患病。據(jù)相關(guān)報道，微小扇頭蜱可通過傳播立克次體（Rickettsia）引發(fā)斑點(diǎn)熱、傳播伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）引發(fā)萊姆病，威脅人類健康[10]。還可傳播內(nèi)羅畢綿羊病（Nairobi sheep disease）和無漿體病。

圖2 牛蜱核糖體ITS1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 牛蜱核糖體ITS2 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2）核糖體DNA（rDNA）是編碼核糖體RNA（rRNA）的基因，在真核生物中以串聯(lián)多拷貝的形式組成龐大的多基因家族， 每一單位都包括NTS、ETS、18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2、28S rDNA[11]。rDNA 為串狀重復(fù)序列， 包括編碼區(qū)18S、5.8S 和28S rDNA 的基因， 其間的間隔區(qū)包括ITS1 及ITS2非編碼區(qū)。 由于ITS1、ITS2 基因不受選擇壓力的影響，因而種內(nèi)具有高度保守性。在真核生物中，rDNA的ITS 序列進(jìn)化速度是非常迅速的， 因此種間的變異較大且具多態(tài)性。 ITS 序列所表現(xiàn)出的這些特性，為獸醫(yī)寄生蟲學(xué)的生物多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、分子分類學(xué)研究、 進(jìn)化關(guān)系研究以及種屬鑒定等提供了理想標(biāo)記[12]。 張新高等[13]對廣州動物園采集的華南虎絳蟲的rDNA 進(jìn)行序列分析后認(rèn)為， 分離的絳蟲屬于迭宮屬的猬迭宮絳蟲。 ZHU X Q 等[14]對中國源以及歐洲源的異尖線蟲基于rDNA 的ITS-1 及ITS-2 序列PCR 擴(kuò)增方法進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果證明rDNA 的ITS 是一種理想的分子遺傳標(biāo)記，能夠有效區(qū)分、 鑒別不同種屬及來源的異尖線蟲。 ZHU X Q等[14]選擇rDNA 的5.8S DNA 和ITS1、ITS2 做分子遺傳標(biāo)記， 經(jīng)PCR-RFLP 技術(shù)和PCR-SSCP 技術(shù)，證實(shí)這兩種分子標(biāo)記技術(shù)均能有效區(qū)分犬首弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲。 PRASAD P K 等[15]對布氏姜片吸蟲rDNA 基于ITS 區(qū)域序列進(jìn)行測序分析，證明布氏姜片吸蟲rDNA 的ITS 序列及其組成不因其發(fā)育階段不同而存在差異，具有高度保守性，進(jìn)一步證明rDNA 的ITS 區(qū)域是一種有效的分子遺傳標(biāo)記。目前可見許多關(guān)于應(yīng)用ITS 序列作為分子標(biāo)記進(jìn)行蜱蟲鑒別的相關(guān)報道[16-17]。 與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)相比，分子生物學(xué)鑒定不但簡單快速， 且對于蜱類的分類研究更加準(zhǔn)確，更利于我國對蜱種的分類鑒定、進(jìn)化關(guān)系及生物多樣性研究[18]。

3）采集福建龍巖地區(qū)某牛場牛蜱樣本，設(shè)計特異性引物，對牛體表分離獲得的牛蜱核糖體DNA 的ITS1 和ITS2 基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD18-T 載體后測序， 通過與GenBank 已發(fā)表的國內(nèi)外蜱蟲基因序列進(jìn)行比對， 結(jié)合核酸測序分析，從而確定其分類地位。 結(jié)果表明，龍巖地區(qū)分離的牛蜱為微小扇頭蜱，ITS1 序列與國內(nèi)甘肅、湖南的微小扇頭蜱同源性均達(dá)到99%以上， 其中1%微小的差異可能是由于種內(nèi)遺傳的多態(tài)性所致或者試驗(yàn)過程測序反應(yīng)中堿基的錯配；ITS2 序列與南非豪登、中國河南的微小扇頭蜱同源性均達(dá)100%。 種系發(fā)育分析結(jié)果顯示， 龍巖地區(qū)牛體表分離的牛蜱ITS 基因序列與扇頭蜱屬ITS 基因序列聚類，與革蜱屬、璃眼蜱屬處于兩個不同的分支。本項(xiàng)研究結(jié)果為蜱蟲的進(jìn)一步分類、 鑒定和進(jìn)化關(guān)系研究提供科學(xué)依據(jù)。