銀耳多糖超聲波提取工藝優(yōu)化及抗BV2細胞炎癥的作用研究

謝玲娜，韓 萍，杜志云

（1. 廣東工業(yè)大學 生物醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510006；2. 佛山市康伲愛倫生物技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528225）

銀耳(Tremella fuciformis)屬于真菌門，擔子菌綱，異隔擔子菌亞綱。銀耳目，銀耳科，銀耳屬[1]。銀耳有很多的別名，如雪耳、白木耳等。銀耳是一種常見的食用菌，在福建、四川、貴州、浙江、湖北等地廣泛種植。銀耳多糖具有廣泛的生物學活性和功能，包括抗衰老[2]、抗氧化[3-5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7-8]和降低血糖[9]等。傳統(tǒng)的銀耳多糖提取工藝有酶提取法、酸提取法、堿提取法和熱水浸提法等[10-15]。超聲波輔助提取工藝是近年來較為常用的一種多糖提取方法，具有省時高效、節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點[16-17]。本文采用熱水浸提法，輔以超聲波提取工藝提取銀耳多糖，通過對超聲波功率、提取料液比、提取溫度和提取時間進行單因素試驗，并通過正交試驗，確定最佳提取工藝。本研究還建立了脂多糖致小膠質(zhì)細胞炎癥模型，探討銀耳多糖的抗炎活性，為銀耳多糖的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

銀耳產(chǎn)自四川通江，購自佛山市愛倫生物技術(shù)有限公司。苯酚、濃硫酸、葡萄糖均為分析純，購自阿拉丁化學試劑；無水乙醇、甲醇購自天津大茂化學試劑廠；脂多糖購自Sigma公司。DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)、胎牛血清購自美國Gibco公司。BCA蛋白檢測試劑盒（BCA Protein Assay Kit）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TRPV1Elisa試劑盒購自江蘇酶標生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器

高速多功能粉碎機(武義海納電器有限公司)、DK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏儀器設(shè)備有限公司)、超聲波發(fā)生儀(VS-100UE，無錫沃信儀器制造有限公司)、Z326K離心機(賀默(上海)儀器科技有限公司)、全波長酶標儀Multiskan GO(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.2 銀耳多糖超聲波提取工藝優(yōu)化

1.2.1 銀耳多糖的提取

將銀耳子實體干制品經(jīng)粉碎過80目篩，得到銀耳碎粉。稱取30 g銀耳碎粉，加入適量去離子水浸潤30 min后，置于超聲波提取設(shè)備中，按照設(shè)定條件進行超聲波輔助提取、過濾，銀耳提取液在5000r/min離心10 min，取銀耳多糖上清液，在60 ℃條件下減壓濃縮至溶液體積的1/10，加入濃縮液體積4倍量的無水乙醇，重復1次，醇沉過夜。取多糖沉淀物冷凍干燥，即得銀耳多糖。

1.2.2 銀耳多糖提取率的測定

總糖含量的測定：參考文獻方法，采用苯酚?硫酸法測定銀耳多糖的總糖含量[18-19]。取適量葡萄糖置于105 ℃烘箱烘干至恒重，取干燥好的葡萄糖標準品100 mg置100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標準儲備液。精密移取標準儲備液1，2，4，6，8，10 mL置100 mL容量瓶，加蒸餾水定容，配制系列質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL的系列標準溶液。分別移取上述系列葡萄糖標準溶液1 mL置10 mL具塞玻璃試管中，依次加入0.5 mL苯酚溶液，濃硫酸2.5 mL，充分渦旋，冷卻至室溫，另取1 mL蒸餾水作為空白對照，將上述溶液于490 nm波長處測定溶液的吸光度值，以質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得回歸方程：y=10.25x+0.013，R2=0.999 7。表明葡萄糖標準品在0.01～ 0.1 mg/mL內(nèi)質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

提取率的測定：取銀耳多糖提取液1 mL置10 mL具塞玻璃試管中，依次加入0.5 mL苯酚溶液，濃硫酸2.5 mL，充分渦旋，冷卻至室溫，于490 nm波長處測定溶液的吸光度值。將測得的吸光度值代入標準曲線方程，計算得到銀耳多糖質(zhì)量濃度。再將銀耳多糖質(zhì)量濃度代入式（1）計算，即得銀耳多糖提取率

其中，C為測得吸光度對應(yīng)的質(zhì)量濃度，V為提取液的體積，M為銀耳碎粉質(zhì)量。

1.2.3 銀耳多糖提取單因素試驗

粉碎過篩后的銀耳粉末，按照表1的設(shè)定條件進行多糖提取。

表1 單因素實驗Table 1 Single factor experiment

1.2.4 銀耳多糖提取最佳工藝條件的確定

通過單因素試驗所得工藝，以超聲波頻率，提取料液比和提取溫度為試驗因素設(shè)計三因素三水平的正交試驗，確定超聲波輔助熱水浸提銀耳多糖的最佳工藝條件，正交試驗因素水平見表2。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

1.3 銀耳多糖對LPS誘導BV2細胞的TRPV1調(diào)控作用

細胞培養(yǎng)：將BV2小膠質(zhì)細胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中。每日觀察細胞形態(tài)，待BV2細胞融合達約80%時，進行傳代培養(yǎng)。

藥物干預(yù)：取對數(shù)生長期的BV2細胞，在倒置顯微鏡下觀察，細胞生長至80%左右時，進行實驗。在6孔板中接種BV2小膠質(zhì)細胞(5×104個細胞每孔)，實驗分為3組：空白對照組、單獨LPS(質(zhì)量濃度為1 μg/mL)處理組和LPS+銀耳多糖(質(zhì)量濃度為62.5，250，1 000 μg/mL)組。LPS組在不含血清的培養(yǎng)基中加入LPS，最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL；LPS+銀耳多糖組先分別用加入銀耳多糖(質(zhì)量濃度為62.5，250，1 000 μg/mL)的不含血清培養(yǎng)基處理2 h，隨后加入LPS，最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，收集細胞，進行細胞裂解，進一步進行蛋白測定。

細胞裂解：(1) 將收集到的細胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，5 000 r/min 離心5 min；(2) 棄去上清液，加入1 mL PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，5 000 r/min離心10 min；(3) 棄去上清液，每管加入150 μL細胞裂解液，吹打均勻，冰上反應(yīng)10 min，離心(4 ℃，12 000 r/min，5 min)，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到1 mL的EP管中，使用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量，檢測提取蛋白的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析，采取 t檢驗，相關(guān)系數(shù)用R表示，p值＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素優(yōu)化實驗

2.1.1 超聲波功率對銀耳多糖提取率的影響

在料液比為1∶40 (g·mL-1)、提取溫度為60 ℃、提取35 min的條件下，測定超聲波功率對銀耳多糖提取率的影響，實驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，銀耳多糖的提取率隨超聲波功率升高而上升，可能是因為超聲波能輔助破壞細胞壁，多糖溶出加快，當超聲波功率達到350 W后，銀耳多糖提取率增加幅度較低，銀耳多糖接近溶出極限，因此選取350 W為較佳超聲波功率。

圖1 超聲波功率對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on polysaccharide extraction rate

2.1.2 提取料液比對銀耳多糖提取率的影響

在超聲波功率為350 W，提取溫度為60 ℃，提取35 min的條件下，測定提取料液比(g/mL)對銀耳多糖提取率的影響，實驗結(jié)果如圖2。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，銀耳多糖的提取率隨提取料液比的較小而上升，當料液比為1∶40 (g·mL-1)時，隨著料液比增大，銀耳多糖提取率增加較少，料液比對銀耳多糖溶出影響不明顯，因此選取1∶40為較佳提取料液比。

圖2 提取料液比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction material-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.1.3 提取溫度對銀耳多糖提取率的影響

在超聲波功率為350 W、提取料液比為1∶40(g·mL-1)、提取35 min的條件下，測定提取溫度(℃)對銀耳多糖提取率的影響，實驗結(jié)果如圖3。由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，銀耳多糖提取率增加，這是因為溫度升高促進了細胞裂解，加快了多糖溶出。當溫度達到60 ℃時，溫度升高對銀耳多糖的提取率升高不明顯，因此選取60 ℃為較佳提取溫度。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

2.1.4 提取時間對銀耳多糖提取率的影響

超聲波功率為350 W、提取溫度為60 ℃、提取料液比為1∶40 (g·mL-1)的條件下，測定提取時間(min)對銀耳多糖提取率的影響。實驗結(jié)果如圖4所示，隨著提取時間的增加，銀耳多糖的提取率增加，當提取時間超過35 min時，提取時間的增加對多糖提取率的影響不明顯，因此選取35 min為較佳提取時間。

圖4 提取時間對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

2.2 超聲波輔助熱水浸提銀耳多糖最佳工藝的確定

由表3可見，極差B＞A＞C，即提取條件對銀耳多糖提取率的影響：超聲波功率＞料液比＞溫度。不同水平情況中，料液比K2＞K3＞K1，則最佳水平為A2；超聲波功率K3＞K2＞K1，則最佳水平為B3；提取溫度K3＞K2＞K1，則最佳水平為C3。最佳工藝是A2B3C3，即提取料液比為1∶40 (g·mL-1)，超聲波功率為450 W，提取溫度為70 ℃，提取2次，提取時間為35 min。

由表4可知，B的F值最大，其次是A，再次是C，即對銀耳多糖提取率的影響超聲波功率＞料液比＞溫度。方差分析得出的影響因素強弱與極差分析得出的結(jié)論相同，可雙重驗證實驗分析結(jié)果。

2.3 銀耳多糖對LPS誘導的BV2細胞作用后的TRPV1結(jié)果分析

通過不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖干預(yù)LPS誘導的BV2細胞損傷，來探討銀耳多糖對神經(jīng)炎癥的影響。實驗結(jié)果如圖5所示，與LPS組相比，不同質(zhì)量濃度的銀耳多糖(62.5，250，1 000 μg/mL)作用后，LPS+銀耳多糖組的TRPV1 的表達量明顯下降，且隨著銀耳多糖質(zhì)量濃度的升高而降低。結(jié)果表明，銀耳多糖對于LPS誘導的BV2細胞損傷具有預(yù)保護作用，而且具有濃度依賴性。

表3 正交試驗結(jié)果表Table 3 Table of orthogonal test results

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

圖5 銀耳多糖對LPS誘導的BV2細胞損傷的預(yù)保護作用Fig.5 Pre-protective effect of Tremella polysaccharide on LPSinduced BV2 cell injury

3 結(jié)論

通過對超聲波輔助熱水浸提銀耳多糖的工藝條件進行優(yōu)化，得到的較佳的工藝條件為：提取料液比為1∶40 (g·mL-1)，超聲波功率為450 W，提取溫度為70 ℃，提取時間為35 min。研究結(jié)果表明，所得到的銀耳多糖能夠明顯抑制LPS誘導的BV2細胞TRPV1的分泌，提示銀耳多糖可能具有良好的抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥的作用，可能在防治與神經(jīng)炎癥相關(guān)的疾病，如阿爾茨海默病等方面具有一定的效果。本研究所使用的銀耳多糖為粗提物，仍然含有一定的雜質(zhì)，需要進行進一步的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，明確其單糖組成及結(jié)構(gòu)，再進行藥理活性研究，明確確切的抗炎藥效成分，以便進一步開發(fā)利用。