丁香酚抗馬拉色菌活性、細(xì)胞毒性及抑菌機(jī)制研究

劉 迪，郭清泉，趙海山，舒均中，練英鐸，夏樹敏

（1. 廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3. 澳寶化妝品(惠州)有限公司，廣東 惠州 516255）

頭皮屑是一種常見(jiàn)問(wèn)題，典型的頭皮屑是指頭皮上或頭發(fā)里出現(xiàn)薄片狀皮屑，且大多情況下伴有明顯的瘙癢。各種內(nèi)在和環(huán)境因素，如皮脂分泌、馬拉色菌定植、個(gè)體易感性以及這些因素之間的相互作用，都是導(dǎo)致產(chǎn)生頭皮屑的原因[1-3]。

馬拉色菌是一種寄生于人和動(dòng)物皮膚表面的嗜脂性真菌，能夠分泌多種具有廣譜活性的脂肪酶，將皮脂中的甘油三酯水解成脂肪酸。由于馬拉色菌缺少Δ9去飽和酶，只能代謝飽和脂肪酸并由此產(chǎn)生促炎性不飽和脂肪酸的聚集，刺激皮膚屏障進(jìn)而引起角質(zhì)層脫落，因此一直認(rèn)為該菌是頭皮屑及脂溢性皮炎的病原菌[4-5]。

去除頭皮屑需要抑制馬拉色菌的過(guò)度增殖，抑制馬拉色菌的傳統(tǒng)去屑劑主要有酮康唑、氯咪巴唑、ZPT、OCT等[6]。酮康唑?qū)︸R拉色菌相關(guān)感染的治療效果不佳，復(fù)發(fā)率較高，臨床安全性較低，我國(guó)已禁止其在化妝品中使用。氯咪巴唑長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生一定程度的耐受性，且唑類殺菌劑對(duì)藻類、魚類等水生生物有毒害作用。ZPT有較強(qiáng)的脫脂作用，但因其難以溶解，配制去屑產(chǎn)品時(shí)必須保證其不發(fā)生沉淀[7-9]。植物成分是合成藥物的可行替代品，在過(guò)去的幾十年里，化妝品中天然產(chǎn)物的使用急劇增加[10]，人們對(duì)含有植物成分的化妝品的認(rèn)知和需求正在上升。因此，開發(fā)具有副作用小、環(huán)保、來(lái)源廣并且適合長(zhǎng)期及預(yù)防性應(yīng)用的植物來(lái)源去屑成分具有重要意義。

丁香酚主要來(lái)源于丁香揮發(fā)油等富含丁香酚的精油，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化和抗癌等藥理活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、香料、香精、化妝品等多個(gè)行業(yè)得到應(yīng)用[11]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)丁香精油對(duì)馬拉色菌有較好的抑菌活性[12-13]，但尚未應(yīng)用于去屑，丁香酚與傳統(tǒng)去屑劑的相互作用和對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的毒性尚不明確，對(duì)馬拉色菌的作用機(jī)制也未見(jiàn)報(bào)道。為了研究丁香酚與傳統(tǒng)去屑劑的相互作用和安全性，以及對(duì)馬拉色菌的作用機(jī)制，本文通過(guò)體外藥敏實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了丁香酚及其聯(lián)用傳統(tǒng)去屑劑對(duì)糠秕馬拉色菌(Malassezia furfur，M. furfur)的抑菌活性，用MTT法評(píng)價(jià)了對(duì)HaCaT細(xì)胞的毒性，并通過(guò)SEM和TEM初步研究了丁香酚對(duì)于糠秕馬拉色菌的作用機(jī)制，為丁香酚在去屑產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

丁香酚，上海麥克林生化科技有限公司，純度99%；酮康唑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度98%；ZPT，上海麥克林生化科技有限公司，純度96%；OCT，氯咪巴唑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度98%；改良Dixon培養(yǎng)基 (mDixon)，青島海博生物技術(shù)有限公司；DMEM(高糖)培養(yǎng)液，胎牛血清，胰蛋白酶，雙抗(青霉素-鏈霉素)，PBS緩沖液，美國(guó)Gibco；MTT，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2.5%戊二醛固定液，北京索萊寶科技有限公司。

糠秕馬拉色菌 (ATCC 44344)購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。

人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(Immortal Keratinocytes，HaCaT)，購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司。

生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；多功能酶標(biāo)儀，德國(guó)Berthold公司；光學(xué)顯微鏡，明美光電技術(shù)有限公司；離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；聚焦離子束場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(LYRA 3 XMU)，捷克Tescan；透射電子顯微鏡(Tecnai Spirit)，美國(guó)FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

將丁香酚、酮康唑、OCT、氯咪巴唑用95%乙醇溶解，分別配至400，10，40，40 mg/mL；將ZPT用95%乙醇分散至20 mg/mL，超聲分散，使用前振蕩均勻。MTT用PBS溶解配至5 mg/mL，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 最低抑菌濃度 (MIC) 和最低殺菌濃度 (MFC)的測(cè)定

將馬拉色菌凍干粉活化，在32 ℃培養(yǎng)72 h后，用接種環(huán)挑取若干菌落至無(wú)菌生理鹽水，吹吸數(shù)次，將濁度調(diào)整至麥?zhǔn)?#比濁管，經(jīng)平板計(jì)數(shù)其菌液濃度為(2～4)×106CFU/mL，將菌懸液用mDixon培養(yǎng)基稀釋100倍。將丁香酚、酮康唑、ZPT、OCT、氯咪巴唑用無(wú)菌培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度，備用。

參照NCCLS提出的標(biāo)準(zhǔn)(M27-A3方案)，采用微量稀釋法在96孔板的1～11列分別加入100 μL無(wú)菌培養(yǎng)基，將稀釋后的丁香酚、酮康唑、ZPT、OCT、氯咪巴唑取100 μL加至第1列，倍比稀釋至第10列，1～11列每孔加入100 μL菌液，第 11列設(shè)生長(zhǎng)對(duì)照，第12列加入200 μL培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。32 ℃培養(yǎng)72 h后，測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的光密度(Optical Density，OD)值，計(jì)算每孔的抑制率，取抑制率≥80%的孔的最低藥物濃度作為該藥的MIC。抑制率計(jì)算公式為

取孔內(nèi)培養(yǎng)液涂布平板，培養(yǎng)3 d后無(wú)菌生長(zhǎng)的平板對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度作為MFC。

1.2.3 聯(lián)合抑菌指數(shù)值測(cè)定

丁香酚與酮康唑、ZPT、OCT、氯咪巴唑的相互作用按照棋盤微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定[14]。根據(jù)各去屑劑的MIC值將其連續(xù)稀釋后分別加至96孔板，然后將連續(xù)稀釋的丁香酚加入各板，最后將稀釋后的菌懸液加入孔板使其終濃度為(1～2)×104CFU/mL。將孔板置于32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，用酶標(biāo)儀測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以聯(lián)合抑菌指數(shù) (Fractional Inhibitory Concentration, FIC) 來(lái)評(píng)價(jià)兩者的聯(lián)合效應(yīng)。

A和B分別為丁香酚和傳統(tǒng)去屑劑，MICA和MICB分別為A和B單用時(shí)的MIC值。MICA聯(lián)用是A和B聯(lián)用時(shí)A的MIC值，MICB聯(lián)用是A和B聯(lián)用時(shí)B的MIC值。當(dāng)FIC≤0.5時(shí)為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1時(shí)為相加作用；1＜FIC≤2時(shí)為無(wú)關(guān)作用；當(dāng)FIC＞2時(shí)為拮抗作用。

1.2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整至1×105個(gè)/mL，并以100 μL每孔接種至96孔板，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，用DMEM完全培養(yǎng)基將丁香酚稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度，取100 μL加至每孔，每組藥物設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)控制組和空白組。分別培養(yǎng)12，24，36和48 h，棄去上清液，每孔加入0.5 mg/mL的MTT 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處的OD值。

細(xì)胞活力計(jì)算公式為

1.2.5 SEM和TEM對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察

將M. furfur傳代2次后，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌生理鹽水中，用mDixon培養(yǎng)基稀釋至(2～4)×105CFU/mL。將黏附載玻片切割成邊長(zhǎng)5 mm大小正方形，酒精清洗后干燥，并放入24孔板中，每孔加1 mL稀釋好的含菌培養(yǎng)液，32 ℃培養(yǎng)24 h后，將載玻片轉(zhuǎn)移到加藥培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出載玻片，用生理鹽水沖洗，2.5%戊二醛固定，經(jīng)30%，50%，70%，90%，100%乙醇梯度脫水，每次5 min，用100%乙醇再處理20 min，冷凍干燥。噴金5 min，將載玻片黏附于樣品臺(tái)上，在加速電壓為5 kV的掃描電子顯微鏡下觀察。

將M. furfur菌懸液用mDixon培養(yǎng)基稀釋至(2～4)×105CFU/mL，32 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，加入丁香酚至MIC濃度，并設(shè)酮康唑?qū)φ战M和空白組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以3 000 r/min離心，用PBS漂洗，分別用2.5%戊二醛和1%鋨酸溶液固定，后經(jīng)30%，50%，70%，90%，100%乙醇梯度脫水，再用100%乙醇處理20 min。用包埋劑與丙酮的混合液(V包埋劑/V丙酮=1/1)處理樣品1 h，再用包埋劑與丙酮的混合液(V包埋劑/V丙酮=3/1)處理樣品3 h。將經(jīng)過(guò)滲透處理的樣品包埋起來(lái)，70 ℃加熱過(guò)夜，即得到包埋好的樣品。樣品在超薄切片機(jī)中切片，切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色10 min，用加速電壓為80 kV的透射電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥敏試驗(yàn)

丁香酚、酮康唑、ZPT、OCT、氯咪巴唑?qū). furfur的抗菌活性結(jié)果見(jiàn)表1。丁香酚的MIC為312.50 μg/mL，MFC為625.00 μg/mL，酮康唑、ZPT和氯咪巴唑表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性。

表1 各藥物單獨(dú)用藥對(duì)糠秕馬拉色菌的MIC和MFCTable 1 MIC and MFC of each drug against M. furfur μg/mL

確定了各藥物的MIC后，對(duì)二元組合的潛在協(xié)同作用進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果如表2所示。丁香酚與酮康唑聯(lián)合用藥時(shí)，F(xiàn)IC值為0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用；與ZPT聯(lián)用時(shí)，F(xiàn)IC值為0.75，表現(xiàn)為相加作用；與OCT聯(lián)用時(shí)，F(xiàn)IC值為1.00，表現(xiàn)為相加作用；與氯咪巴唑聯(lián)用時(shí)，F(xiàn)IC值為0.75，表現(xiàn)為相加作用。各藥物的聯(lián)用MIC值相比于MIC值降低了50%～75%，這說(shuō)明在聯(lián)合用藥時(shí)，降低各藥物的濃度可以達(dá)到相同的抑菌效果。

表2 丁香酚與各藥物聯(lián)合用藥對(duì)糠秕馬拉色菌的FICTable 2 The FIC of eugenol combined with each drug against M. furfur

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

丁香酚對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響如圖1所示，在31.25～500 μg/mL劑量范圍內(nèi)培養(yǎng)12, 24, 36, 48 h，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HaCaT細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)濃度?時(shí)間依賴關(guān)系。丁香酚作用12 h，隨丁香酚濃度增加至250 μg/mL，細(xì)胞增殖未受到明顯的影響，濃度大于250 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率驟減；丁香酚分別作用24，36，48 h時(shí)，細(xì)胞存活率隨濃度增大不斷降低；在相同的丁香酚濃度下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率降低；分別作用24，36，48 h時(shí)，細(xì)胞存活率差異不明顯。通過(guò)雙因素方差分析，P＜0.01,濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率有非常顯著(**)的影響。

圖1 丁香酚對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of eugenol on proliferation of HaCaT cells

同時(shí)評(píng)價(jià)了酮康唑、ZPT、OCT、氯咪巴唑?qū)aCaT細(xì)胞的毒性。分別作用24 h后，細(xì)胞活力與藥物濃度的關(guān)系如圖2所示。

圖2 酮康唑、ZPT、OCT、氯咪巴唑?qū)aCaT細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of ketoconazole, ZPT, OCT and climbazole on proliferation of HaCaT cells

用SPSS Statistics進(jìn)行Probit分析，計(jì)算得到各藥物對(duì)HaCaT細(xì)胞的半抑制濃度IC50，如表3所示。結(jié)果顯示，丁香酚的IC50為320.93 μg/mL，與其他傳統(tǒng)去屑劑相比，在細(xì)胞水平上有較高的安全性。

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性的結(jié)果，丁香酚(MIC:312.5 μg/mL, IC50: 320.93 μg/mL)與ZPT (MIC: 7.50 μg/mL，IC50: 0.662 μg/mL)、OCT (MIC:62.50 μg/mL, IC50:33.10 μg/mL)相比，安全窗口較大。酮康唑由于長(zhǎng)期使用會(huì)引起斷發(fā)等副作用已禁止用于洗發(fā)水，氯咪巴唑由于易產(chǎn)生耐藥性和環(huán)境污染問(wèn)題也較少使用[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)丁香酚有效抑菌濃度值高于傳統(tǒng)傳統(tǒng)去屑劑，但與傳統(tǒng)去屑劑聯(lián)用時(shí)可將各藥物的有效濃度降低50%～75%，因此可以通過(guò)聯(lián)用來(lái)提高抑菌效果，降低細(xì)胞毒性和副作用。

表3 丁香酚和各傳統(tǒng)去屑劑對(duì)HaCaT細(xì)胞的IC50值Table 3 IC50 values of eugenol and traditional antidandruff agents on HaCaT cells

2.3 SEM和TEM對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察

圖3是經(jīng)MIC濃度的丁香酚處理后的M. furfur細(xì)胞和酮康唑?qū)φ战M以及正常細(xì)胞的SEM圖。圖3(a)是不加藥物的空白對(duì)照組，可見(jiàn)較厚的細(xì)胞外基質(zhì)組成的生物膜結(jié)構(gòu)覆蓋在細(xì)胞上，細(xì)胞完整，表面平滑。圖3(b)是經(jīng)過(guò)MIC濃度的酮康唑處理的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)生皺縮，生物膜明顯減少。圖3(c)是經(jīng)MIC濃度的丁香酚處理的細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮和塌陷，芽孢斷裂，細(xì)胞破損，生物膜的合成明顯減少。

圖4是M. furfur細(xì)胞的TEM圖。圖4(a)是正常細(xì)胞，細(xì)胞壁厚度均一，細(xì)胞核呈圓形，核膜清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面可見(jiàn)核糖體附著，脂滴相對(duì)較多。圖4(b)是MIC濃度的酮康唑處理48 h后的細(xì)胞，可見(jiàn)其細(xì)胞膜破損、溶解，胞內(nèi)基質(zhì)游離。細(xì)胞核呈不規(guī)則形，線粒體重度腫脹，膜溶解、消失，其內(nèi)基質(zhì)變淡；液泡膜溶解。圖4(c)是MIC濃度的丁香酚處理48 h后的細(xì)胞，細(xì)胞壁局部破損，胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)消失，溶解，細(xì)胞膜凹陷，局部質(zhì)壁分離。細(xì)胞核呈不規(guī)則形，染色質(zhì)溶解，核膜模糊；線粒體腫脹，膜結(jié)構(gòu)模糊，其內(nèi)基質(zhì)變淡；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，脫顆粒，脂滴減少。

圖3 M. furfur細(xì)胞的SEM圖像Fig.3 SEM images of M. furfur cells

圖4 M. furfur細(xì)胞的TEM圖像Fig.4 TEM images of M. furfur cells

已有研究表明丁香酚對(duì)真菌的抑菌機(jī)理與破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整性和通透性有關(guān)。Cai R等[15]認(rèn)為丁香酚破壞魯氏酵母細(xì)胞膜的完整性和通透性，對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成不可逆損傷。de Oliveira Pereira等[16]認(rèn)為丁香酚作用于紅色毛癬菌的機(jī)制涉及抑制麥角甾醇的合成，由于麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分，低麥角甾醇含量干擾細(xì)胞膜的完整性和功能。Darvishi[17]等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚干擾了釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)膜的兩種通透酶，Tat1p和Gap1p，它們都參與通過(guò)酵母細(xì)胞質(zhì)膜的芳香族化合物和支鏈氨基酸的雙重轉(zhuǎn)運(yùn)。但是迄今為止還未見(jiàn)丁香酚與M.furfur作用機(jī)制的研究報(bào)道，根據(jù)SEM和TEM測(cè)試結(jié)果，丁香酚會(huì)破壞M. furfur細(xì)胞壁，使其凹陷、皺縮，并且破壞細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜凹陷，發(fā)生質(zhì)壁分離，引起核膜和線粒體膜的溶解?？梢钥闯?，丁香酚對(duì)M. furfur的抗真菌活性是通過(guò)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的，其與化學(xué)去屑劑的協(xié)同作用可能由于對(duì)M. furfur細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的破壞而加速了化學(xué)去屑劑的作用。丁香酚對(duì)M. furfur的進(jìn)一步作用機(jī)制有待于更深入的研究。

3 結(jié)論

(1) 本文通過(guò)體外藥敏實(shí)驗(yàn)研究了丁香酚對(duì)糠秕馬拉色菌的抑菌活性，其MIC值為312.50 μg/mL，MFC值為625.00 μg/mL。通過(guò)棋盤微量稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了丁香酚聯(lián)用傳統(tǒng)去屑劑的相互作用，丁香酚與酮康唑聯(lián)合使用對(duì)馬拉色菌有協(xié)同作用，與ZPT、OCT、氯咪巴唑聯(lián)用有相加作用。聯(lián)合使用可以將各藥物的最低有效濃度降低50%～75%。

(2) 通過(guò)對(duì)HaCaT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算丁香酚的IC50為320.93 μg/mL，在細(xì)胞水平上安全性高于傳統(tǒng)去屑劑，與傳統(tǒng)傳統(tǒng)去屑劑聯(lián)用可提高抑菌能力，降低細(xì)胞毒性。

(3) 通過(guò)SEM和TEM的觀察，丁香酚會(huì)破壞M. furfur細(xì)胞壁，使其凹陷、皺縮，并且破壞細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜凹陷，發(fā)生質(zhì)壁分離，引起核膜和線粒體膜的溶解。