納豆銀杏紫蘇軟膠囊毒理學安全性研究

王 婷，黃 妍，譚 蒙，彭 敏，張勛力，張迎慶

(1 湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068； 2 北京納百恩食品有限公司，北京 102200)

納豆、銀杏、紫蘇擁有悠久的食用或藥用歷史[1-3]。納豆具有輔助降血脂、調(diào)節(jié)血糖、增強免疫力、抗衰老等功效[4-6]；銀杏具有抗氧化、拮抗血小板活化因子、降血脂、改善循環(huán)、保護心臟、提高免疫力、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及抗衰老等作用[7-8]；紫蘇油具有降低血脂、減少心腦血管疾病、促進發(fā)育、增強智力、提高記憶力、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、預防老年癡呆癥等作用[10-13]；本研究在前期研究[14]的基礎上，探索納豆凍干粉、銀杏提取物、紫蘇籽油復配軟膠囊的動物毒理學安全性，并為研究和開發(fā)納豆、銀杏和紫蘇同類產(chǎn)品提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品

納百恩牌納豆銀杏紫蘇軟膠囊，由北京納百恩食品有限公司提供(主要原料有納豆凍干粉、銀杏葉提取物、紫蘇籽油、蜂蠟，每100 g含有總黃酮1.5 g，a-亞麻酸40.3 g)。樣品規(guī)格，0.5 g/粒；產(chǎn)品批號，20101011；儲存條件，陰涼干燥處?？诜扑]每人(成人)2次/d，每次2粒，按60 kg為一個成人的體重計算，折合之后的計量為33.3 mg/kg BW。取納豆銀杏紫蘇膠囊內(nèi)容物作為試驗的樣品。

1.2 實驗動物及環(huán)境

健康級別為SPF級的昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心選育繁殖，用于實驗中的動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(桂)2009-0002，其質(zhì)量合格證號為0001270；健康級別為SPF級SD種大鼠，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心選育繁殖，用于實驗中的動物生產(chǎn)許可證編號為SCXK(粵)2008-0002，質(zhì)量合格證號為0062774。實驗中的動物室是一個屏障系統(tǒng)，其使用許可證號為SYXK(桂)2007-0003。動物室的溫度為22～25 ℃，相對濕度為55%～70%。

1.3 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

采用最大劑量試驗法[15]，實驗選用昆明種小鼠20只，體重在18～22 g區(qū)間內(nèi)，雌雄各半。試驗前期，小鼠禁食16 h，但是不限飲水。因為樣品很難溶于水，所以用玉米胚芽油作溶劑，準確稱量50.0 g樣品，添加玉米胚芽油至100 mL后混合均勻，即配制成500 mg/mL濃度的溶液，然后對小鼠進行3次灌胃(每隔4 h一次)，每次灌胃的劑量為0.4 mL/20 g BW，總計量為30000 mg/kg BW。灌胃后觀察并記錄下小鼠的中毒情況。每星期稱量一次小鼠的體重，觀察2個星期。試驗結(jié)束后解剖小鼠，對小鼠進行大體觀察。根據(jù)毒性分級標準評估受試物的急性毒性。

1.4 Ames 試驗

采用TA97a、TA98、TA100、TA102進行試驗。通過鑒定，選取符合要求的組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌。通過二甲基亞砜可以將樣品分別配制成50、10、2、0.4、0.08 mg/mL等5個濃度，并將其作為受試溶液，對樣品進行高壓滅菌(0.103 MPa 20 min)處理后供試驗用。用以PCB誘導的大鼠肝微粒體酶(S-9)作為實驗的體外代謝激活系統(tǒng)。實驗采用平板摻入法，首先將0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL受試物溶液和0.5 mL S-9混合液(當需要代謝活化時)依次加入保溫的頂層培養(yǎng)基中，混合均勻后再倒入底層培養(yǎng)基平板中。5個試驗組的劑量分別為：5000、1000、200、40、8 μg/皿，同時設置回歸對照組、溶劑對照組和陽性突變劑對照組。除了不加樣品外，回歸對照的其余條件均與樣品組一致。在溶劑對照組中，用二甲亞砜替代樣品，其余條件均與樣品組保持一致。各個劑量組的各種菌株均做3個平行皿處理。在37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)48 h左右，計下每皿的菌落數(shù)，整個試驗的流程在相同條件下重復做2次。如果受試物的回變菌落數(shù)的增加超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，且存在劑量-反應關系，即該誘變試驗為陽性[16]。

1.5 小鼠骨髓細胞微核試驗

試驗采用2次經(jīng)口灌胃的方法進行，每次時間間隔24 h。選取昆明小鼠50只作為實驗動物，它們的體重均在25～30 g間，按照雌雄各半的要求隨機分成5個組別，每組各10只小鼠。試驗組設置為3組，3個劑量分別設為10000、5000、2500 mg/kg BW，用玉米胚芽油作為陰性對照，用40 mg/kg BW劑量的環(huán)磷酰胺(cp)作為陽性對照。分別依次準確稱量20.0、10.0、5.0 g的樣品，各自依次加入玉米胚芽油至40 mL，然后混合均勻，將其配制成500、250、125 mg/mL濃度的樣品溶液，然后按0.4 mL/20 g BW 的劑量給小鼠進行灌胃，陰性對照組給予等量的玉米胚芽油進行灌胃，陽性對照組給予等量的環(huán)磷酰胺溶液(2 mg/mL)進行灌胃。在第2次給樣后的6 h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出小鼠的胸骨骨髓然后用小牛血清稀釋涂片，用甲醇固定，在光學顯微鏡下進行Giemsa染色，每1000個嗜多染紅細胞(PCE)一只小鼠，用含微核的PCE千分率計算微核率，同時計數(shù)200個PCE，計算出PCE/NCE的值。統(tǒng)計處理采用泊松分布均數(shù)比較法[15]。如試驗組的微核率高于陰性對照組，且兩者之間存在顯著的劑量-反應關系和統(tǒng)計學意義，即為陽性結(jié)果。

1.6 小鼠精子畸形試驗

選取50只健康的昆明種雄性小鼠，其體重在25～35 g之間，將所選的小鼠隨機分為5組，每組包含10只。設置3個試驗組，劑量分別設為10000、5000、2500 mg/kg BW，用玉米胚芽油作為陰性對照，用40 mg/kg BW劑量的環(huán)磷酰胺(cp)作為陽性對照[17]。分別準確稱量樣品20.0、10.0、5.0 g，然后加入玉米胚芽油直至40 mL，混合均勻、最后可配制成500、250、125 mg/mL濃度的樣品溶液，按照0.4 mL/20 g BW的劑量給小鼠進行灌胃，陽性對照組用等量的2 mg/mL環(huán)磷酰胺對小鼠進行灌胃。灌胃的頻率為1次/d，連續(xù)灌胃5 d。小鼠在最后一次給樣后的第30天被處死，取出小鼠副睪的精子涂片，用甲醇固定，伊紅染色。在光鏡下，每只小鼠統(tǒng)計1000個完整精子，采用χ2檢驗統(tǒng)計處理并計算精子畸形率。如果試驗組的精子畸形率高于陰性對照組的精子畸形率，并且存在顯著劑量-反應關系和統(tǒng)計學意義，即為陽性結(jié)果。

1.7 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗

1.7.1 劑量選擇與受試物的給予方式選取健康級別為SPF級SD種大鼠80只，雌雄各一半，雄鼠的體重為74.4±3.6 g，雌鼠的體重為68.3±3.5 g。將所選的大鼠隨機分為4組，1組為陰性對照組，3組為試驗組，每組分別為20只大鼠，雌雄各半。3個試驗組的劑量分別設為3333、2500和1667 mg/kg BW，這些劑量分別相當于人體推薦劑量的100、75和50倍。準確稱量樣品33.30、25.00、16.67 g，然后再加入玉米胚芽油至100 mL，混合均勻后將其配制成333.3、250.0、166.7 mg/mL濃度溶液，相應劑量組按1.0 mL/100 g BW的劑量給大鼠進行灌胃，陰性對照組給大鼠灌給等量的玉米胚芽油，1次/d，連續(xù)灌胃30 d。

1.7.2 實驗方法在實驗過程中，所有大鼠在一個籠子里飼養(yǎng)，且都用普通飼料喂養(yǎng)，并且令大鼠自由攝食飲水。每天觀察大鼠的生長發(fā)育和食物利用率。在實驗后期，大鼠禁食過夜(禁食16 h，不限制飲水)，稱大鼠空腹時的體重，并處死大鼠，采集2份血樣，取其中一份血抗凝用血球計數(shù)儀檢驗Hb、RBC、WBC及其分類、PLT等；取另一份血不抗凝分離出血清，然后用試劑盒和全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT、BUN、Cr、TC、TG、Glu、TP、Alb等項目。采血后，解剖大鼠并對其進行大體觀察，稱量肝臟、腎臟、脾臟和睪丸等器官的重量，計算臟器與機體的比值，然后對肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、睪丸和卵巢等器官進行病理組織學檢查[18]。各劑量組的大鼠大體肉眼檢查沒有看見明顯病變和生化指標變化時，僅對高劑量組和對照組大鼠的主要器官進行組織病理學檢查，如果發(fā)現(xiàn)有病變情況，再分別檢查中、低劑量組相應器官及組織。

1.7.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。在統(tǒng)計分析過程中，首先要對數(shù)據(jù)的方差齊性進行檢驗。如果方差齊，則采用單因素方差分析進行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異后，再用多劑量組均值與對照組均值的兩兩比較采用Dunnett檢驗。如果方差不齊，則應將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為適當?shù)淖兞?，在?shù)據(jù)滿足方差齊性檢驗后，對轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；若轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)仍然不滿足方差齊性的要求，則采用秩和檢驗的方法統(tǒng)計分析[19]。

2 結(jié)果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

將納豆銀杏紫蘇軟膠囊對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果列入表1。從表1可以看出，對小鼠用最大劑量(劑量為30000 mg/kg BW)的樣品進行灌胃后，小鼠生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)中毒癥狀。試驗結(jié)束后解剖小鼠，并對小鼠進行大體觀察，肝、腎、脾、心、肺等主要器官均沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常，故樣品按急性毒性分級屬無毒級。

表1 納豆銀杏紫蘇軟膠囊對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果

2.2 Ames試驗

從表2、表3可以看出，4種試驗菌株TA97a、TA98、TA100、TA102，無論S-9有沒有加入，樣品各劑量組的回變菌落數(shù)都沒有超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，也沒有劑量-反應關系，表明該受試物誘變試驗的結(jié)果為陰性。

表2 納豆銀杏紫蘇軟膠囊Ames試驗結(jié)果(第1次)

表3 納豆銀杏紫蘇軟膠囊Ames試驗結(jié)果(第2次)

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

從表4可以看出，各劑量組小鼠的骨髓細胞微核率與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，而陽性對照組與陰性對照組比較有極顯著性差異(P<0.01)。該樣品對小鼠的骨髓細胞沒有產(chǎn)生損傷作用。

表4 納豆銀杏紫蘇軟膠囊對小鼠的骨髓細胞微核發(fā)生率的影響

2.4 小鼠精子畸形試驗

從表5可以看出，試驗小鼠精子畸形發(fā)生率并沒有發(fā)生顯著變化，樣品各劑量組的精子畸形率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺的陽性對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。所以本實驗樣品對小鼠精子未產(chǎn)生畸變作用。

表5 納豆銀杏紫蘇軟膠囊對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

2.5 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗

2.5.1 動物一般表現(xiàn)在實驗過程中，各組大鼠生長發(fā)育狀態(tài)良好，沒有大鼠出現(xiàn)異常行為和中毒表現(xiàn)。

2.5.2 樣品對大鼠體重及食物利用率的影響對大鼠用3333、2500、1667mg/kg BW劑量的納豆銀杏紫蘇軟膠囊內(nèi)容物進行灌胃30 d。在實驗過程中，樣品的每個劑量組雌雄大鼠的體重，每周的體重增量、每周食物攝入量及食物總攝入量、每周食物利用率及總食物利用率與對照組對比，沒有顯著性差異(P>0.05)，這就表明，該樣品對大鼠的體重增長和食物利用率均沒有明顯的影響。

2.5.3 樣品對大鼠血常規(guī)指標的影響對大鼠用3333、2500、1667 mg/kg BW劑量的納豆銀杏紫蘇軟膠囊內(nèi)容物進行灌胃30 d，樣品的各劑量組雌、雄性大鼠的血紅蛋白、紅細胞總數(shù)、白細胞總數(shù)及其分類、血小板數(shù)與對照組相應各指標比較，均無發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，可知該樣品對大鼠的血常規(guī)指標沒有明顯的影響效果。

2.5.4 樣品對大鼠血液生化指標的影響對大鼠用3333、2500、1667 mg/kg BW劑量的納豆銀杏紫蘇軟膠囊內(nèi)容物進行灌胃30 d，比較樣品各劑量組雌、雄性大鼠的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、血糖與對照組的相應指標，并沒有出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，大鼠的血液生化指標無明顯變化，即樣品對其無明顯影響。

2.5.5 樣品對大鼠臟器重量及臟器/體重比值的影響對大鼠用3333、2500、1667 mg/kg BW劑量的納豆銀杏紫蘇軟膠囊內(nèi)容物進行灌胃30 d，每個劑量組的大鼠的肝、腎、脾、雄鼠睪丸重量和肝/體、腎/體、脾/體、雄鼠睪丸/體比值與對照組相比較，均沒有出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，大鼠的臟器重量及臟器/體重比值也沒有明顯的變化，即樣品對大鼠的臟器重量及臟器/體重的比值沒有明顯影響。

2.5.6 解剖大體觀察及組織學檢查結(jié)果實驗結(jié)束對大鼠進行解剖，然后對各組大鼠進行大體觀察，均沒有發(fā)現(xiàn)明顯病變狀況。因此僅選擇高劑量組和陰性對照組動物的主要器官進行組織病理切片檢查。結(jié)果表明，高劑量組僅有1例、對照組僅有2例雄性大鼠的肝臟組織可見肝細胞輕度脂肪變性，兩組各有1例雌性大鼠的肝組織可見肝細胞點狀壞死，高劑量組僅有1例雄性，而對照組有1例雄性和1例雌性大鼠的肝臟匯管區(qū)可見少量的炎性細胞浸潤；高劑量組和對照組均有1只雌鼠腎臟皮質(zhì)間質(zhì)有少量的炎性細胞浸潤。上述組織病變屬于動物自發(fā)的輕度病變，并且兩組動物的組織病變程度很相似，所以，樣品所致的可能性可以基本排除。其他臟器組織沒有出現(xiàn)組織病理學改變，說明該樣品對大鼠的上述臟器組織沒有損傷作用。

3 結(jié)論

給予小鼠最大劑量(劑量為30000 mg/kg BW)的樣品灌胃后，沒有出現(xiàn)動物有中毒癥狀或死亡現(xiàn)象，所以樣品的急性經(jīng)口毒性為無毒級。3種遺傳毒性試驗(Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗)的結(jié)果全部為陰性；30 d喂養(yǎng)試驗中，用3333、2500、1667 mg/kg BW 等3個劑量(分別相當于人體推薦劑量的100、75、50倍)的樣品連續(xù)30 d給大鼠進行灌胃，在實驗過程中，動物的生長發(fā)育正常，各劑量組大鼠的體重、增重量、進食量、食物利用率、血常規(guī)指標、血液生化指標、臟器重量及臟器/體重的比值等都沒有受到明顯影響；對解剖后的大鼠進行大體觀察和組織病理學檢查，均未出現(xiàn)與樣品有關的異常改變。在試驗劑量范圍內(nèi)，沒有出現(xiàn)該樣品對大鼠產(chǎn)生毒副作用，即納豆凍干粉、銀杏提取物、紫蘇籽油復配軟膠囊具有良好的安全性，對動物健康無任何損害作用和毒副作用。