一例菌落總數(shù)測(cè)量審核的回顧與分析

摘 要：目的：借助測(cè)量審核提高本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平和核心競(jìng)爭(zhēng)力。方法：以中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的作業(yè)指導(dǎo)書為依據(jù)，采用平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法分別對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：配對(duì)t檢驗(yàn)顯示兩種方法的檢測(cè)結(jié)果不具有顯著性差異（P＞0.05），兩種方法的|Z|值均小于2，為滿意結(jié)果。結(jié)論：平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法均可用于菌落總數(shù)的檢測(cè)，檢測(cè)機(jī)構(gòu)可以依據(jù)自身?xiàng)l件選擇合適的方法來檢測(cè)樣品中的菌落總數(shù)。

關(guān)鍵詞：菌落總數(shù)；測(cè)量審核；測(cè)試片

Review and Analysis of a Case of Total Bacterial Count Measurement Audit

SUN Tianjiao1， YANG Hongyin1， ZHANG Weiying2， DING Shuying1， YIN Yanbai1

（1.Jining Institute of Quality Metrology Inspection （Jining Semiconductor and Display Product Quality Supervision and Inspection Center， Jining Fiber Quality Monitoring Center）， Jining 272000， China;"2.Jining Institute for Food and Drug Control， Jining 272000， China）

Abstract： Objective： To improve the testing level and core competitiveness of this laboratory with the help of measurement audit. Method： Based on the operation instructions provided by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine， the samples were tested using the plate counting method and the test piece method. Result： The paired t test showed that there was no significant difference in the detection results of the two methods （Pgt;0.05）. The |Z| values of the two methods were both less than 2， which was a satisfactory result. Conclusion： Both the plate counting method and the test piece method can be used to detect the total number of bacterial colonies. Testing institutions can choose the appropriate method to detect the total number of bacterial colonies in the sample based on their own conditions.

Keywords： total bacterial count; measurement audit; test piece

測(cè)量審核是實(shí)驗(yàn)室向中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)認(rèn)可的機(jī)構(gòu)申請(qǐng)購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)樣品，然后檢測(cè)樣品的某些項(xiàng)目，將檢測(cè)結(jié)果反饋給機(jī)構(gòu)，比較檢測(cè)結(jié)果與參考值，依據(jù)比較結(jié)果來判斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的一種活動(dòng)[1]。它與能力驗(yàn)證一樣都是實(shí)驗(yàn)室控制質(zhì)量的方法，參加這類活動(dòng)可以使檢驗(yàn)人員得到鍛煉，控制實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量，從而提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力。檢測(cè)機(jī)構(gòu)有權(quán)利也有義務(wù)參加測(cè)量審核和能力驗(yàn)證。

菌落總數(shù)是樣品被稀釋到一定程度后與培養(yǎng)基混勻，在經(jīng)過適宜的條件培養(yǎng)后，每克或每毫升樣品中長(zhǎng)出肉眼可見的菌落總數(shù)[2]。菌落總數(shù)常被稱為需養(yǎng)菌數(shù)或雜菌數(shù)，是因?yàn)橛行﹨捬?、微需氧菌或是需特殊營(yíng)養(yǎng)的細(xì)菌等無法生長(zhǎng)，生長(zhǎng)出的菌落也無法分辨種類，但菌落總數(shù)可以作為一個(gè)初步判定產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)。當(dāng)前檢測(cè)菌落總數(shù)的方法主要有平板計(jì)數(shù)法、濾膜法、紙片法等[3]。本文采用平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法分別檢測(cè)同一凍干粉（模擬食品）的菌落總數(shù)，以配對(duì)t檢驗(yàn)法比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異性。本研究可以指導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)室日后菌落總數(shù)的檢測(cè)工作，也可為其他檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)食品、食品接觸材料、一次性餐飲具以及生活用紙中菌落總數(shù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心，外觀呈白色凍干粉狀，保存于真空西林瓶?jī)?nèi)，編號(hào)為MA-FD-001；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；PetrifilmTM細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)試片（3M中國(guó)有限公司）。

BOXUN壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ZVL IUL均質(zhì)器（上海德記行科技發(fā)展有限公司）；BSC-1100B2-Z生物潔凈安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 檢驗(yàn)依據(jù)

參照中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的《測(cè)量審核作業(yè)指導(dǎo)書》（ACAS-TR710-06-03/00）對(duì)樣品進(jìn)行前處理，以平板計(jì)數(shù)法為依據(jù)，測(cè)試片法作為對(duì)比方法，分別檢測(cè)樣品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)樣品制備

參照樣品攜帶的《測(cè)量審核作業(yè)指導(dǎo)書》，準(zhǔn)備約60 mL滅菌稀釋液（滅菌生理鹽水），對(duì)收到處于高真空狀態(tài)下的凍干樣品進(jìn)行再水化。具體操作如下：在無菌環(huán)境下，樣品放置室溫后，小心地開啟西林瓶，防止樣品飛濺出；開啟西林瓶后，立刻加5 mL滅菌生理鹽水再水化；輕微振蕩溶解后，用移液槍轉(zhuǎn)移至無菌瓶中，反復(fù)多次用剩余的55 mL滅菌生理鹽水沖洗西林瓶?jī)?nèi)壁，清洗液合并放入上述無菌瓶中，得到的溶液就等同于60 mL的食品樣品，稱為樣品原液。

1.3.2 樣品的稀釋

先用移液槍分別轉(zhuǎn)移9 mL的滅菌生理鹽水于5個(gè)無菌試管中，再轉(zhuǎn)移1 mL樣品原液緩緩加入一支試管中，振蕩使溶液混勻，稀釋成10-1的樣品勻液，然后再逐步稀釋制備10-2～10-5的樣品勻液。

1.3.3 平板計(jì)數(shù)法

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2022）中平板計(jì)數(shù)法對(duì)1.3.2中的樣品勻液進(jìn)行檢測(cè)。從100～10-5的樣品勻液中各移取1 mL樣品，分別加入瓊脂平板中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，待瓊脂凝固，倒置于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。每個(gè)稀釋度樣品勻液接種2個(gè)平板，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3.4 測(cè)試片法

依據(jù)測(cè)試片的操作說明對(duì)1.3.2中的樣品勻液進(jìn)行檢測(cè)。從100～10-5的樣品勻液中各移取1 mL樣品，分別加入PetrifilmTM細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)試片中，加完樣品后緩慢蓋好上膜，可用壓板去除可能產(chǎn)生的氣泡，待樣品完全吸收后，將測(cè)試片透明面向上置于培養(yǎng)箱36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。每個(gè)稀釋度做2張測(cè)試片，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3.5 菌落總數(shù)計(jì)數(shù)

平板計(jì)數(shù)法采用目視法計(jì)數(shù)，為了方便統(tǒng)計(jì)，可在平板上劃十字區(qū)，用記號(hào)筆逐個(gè)點(diǎn)黑點(diǎn)統(tǒng)計(jì)各個(gè)區(qū)的菌落數(shù)，4個(gè)區(qū)之和乘以稀釋倍數(shù)即為菌落總數(shù)。

PetrifilmTM細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)試片中含有的指示劑可使菌落顯示紅色，且自帶計(jì)數(shù)網(wǎng)格，方便計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)計(jì)算所有紅色菌落。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法同時(shí)檢測(cè)樣品，平行重復(fù)10次，借助統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用t配對(duì)檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，P＜0.05為數(shù)據(jù)有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

對(duì)平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法10次檢測(cè)結(jié)果取平均值，作為最終檢測(cè)結(jié)果，對(duì)比結(jié)果詳見表1。對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果開展配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可知，平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法的檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異（P＞ 0.05），均值分別為4 080 CFU·mL-1和4 100 CFU·mL-1。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2022[4]規(guī)定，當(dāng)菌落總數(shù)≥100 CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約，采用2位有效數(shù)字，后面用0代替位數(shù)，因此兩種方法的報(bào)告值均為4 100 CFU·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)差分別是78.88 CFU·mL-1和81.65 CFU·mL-1，均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為24.94 CFU·mL-1和25.82 CFU·mL-1，說明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)不大，有較好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

研究表明，平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法檢測(cè)凍干粉（模擬食品）中菌落總數(shù)不存在顯著差異，原因可能在于試驗(yàn)條件（接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、儀器設(shè)備）相同，且是同一實(shí)驗(yàn)員在相同環(huán)境下操作，不影響微生物生長(zhǎng)和試驗(yàn)結(jié)果[5]。實(shí)驗(yàn)過程中需注意，樣品的稀釋度一定要合適，避免出現(xiàn)樣品濃度太高，菌落總數(shù)太大的情況。平板計(jì)數(shù)法接種時(shí)，培養(yǎng)基溫度不能過高，樣品勻液與培養(yǎng)基應(yīng)充分混勻，防止菌落生長(zhǎng)成團(tuán)無法計(jì)數(shù)。培養(yǎng)期間應(yīng)關(guān)注菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，切勿等到培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束再去計(jì)數(shù)，防止菌落生長(zhǎng)太大蔓延到一起導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確。最終結(jié)果以在30～300 CFU的平板菌落數(shù)為準(zhǔn)，也可依據(jù)其他濃度的菌落數(shù)結(jié)果來佐證落在此范圍內(nèi)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果。

平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法各有利弊，平板計(jì)數(shù)法需要提前配制瓊脂培養(yǎng)基、滅菌、烘干等，有時(shí)還要采取措施防止菌落蔓延。PetrifilmTM測(cè)試片內(nèi)含紅色指示染劑，可使菌落呈紅色便于計(jì)數(shù)，沒有復(fù)雜的前期準(zhǔn)備工作，節(jié)約時(shí)間，操作快捷，效率高，且檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，缺點(diǎn)是成本高，檢測(cè)機(jī)構(gòu)可根據(jù)自身實(shí)際情況選擇檢測(cè)方法。

開展測(cè)量審核活動(dòng)可評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平，有助于實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)自身問題，提高檢測(cè)人員的檢測(cè)能力。本次檢測(cè)結(jié)果上報(bào)后反饋Z值為-0.1，按照中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心指定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，|Z|≤2.0為滿意結(jié)果，這表明本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)菌落總數(shù)結(jié)果可靠。

參考文獻(xiàn)

[1]楊俊業(yè)，黃玲玲.大腸菌群測(cè)量審核結(jié)果與分析[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（14）：4718-4721.

[2]劉芳，楊平，李傳禮.菌落總數(shù)能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2015，6（11）：4652-4658.

[3]王忠東，于建煥.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定方法的效果分析[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2015（20）：4285-4286.

[4]國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定：GB 4789.2—2022[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2022.

[5]周永.微生物檢驗(yàn)結(jié)果的主要影響因素及質(zhì)量控制策略研究[J].臨床檢驗(yàn)雜志（電子版），2018，7（4）：721-722.