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    人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin—1的克隆及其蛋白表達、純化

    2018-12-22 09:34招樹濤徐永健陳浩云
    中國醫(yī)藥導報 2018年32期
    關(guān)鍵詞:通透性出血性腦水腫

    招樹濤 徐永健 陳浩云

    [摘要] 目的 克隆與人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin-1,并在大腸埃希菌中表達,最后進行蛋白純化、鑒定。方法 根據(jù)基因庫中收錄的Caveolin-1基因序列,設(shè)計其上下游引物,經(jīng)過PCR反應(yīng)合成Caveolin-1雙鏈,然后與pET28a(+)載體重組,篩選陽性克隆并對DNA序列分析鑒定。將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1轉(zhuǎn)入化大腸埃希菌BL21(DE3),異丙基硫代半乳糖苷誘導融合蛋白表達,表達產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析(Ni2+-NTA)純化,SDS-PAGE檢測和Western blot鑒定。 結(jié)果 PCR擴增的Caveolin-1 DNA片段經(jīng)鑒定確認為人Caveolin-1基因。經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導的含有pET28a-Caveolin-1重組質(zhì)粒的DE3菌表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化,獲得了較高純度的融合蛋白。 結(jié)論 本研究成功克隆了人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin-1,并對其進行蛋白表達、純化,獲得了較高純度融合蛋白,為進一步的相關(guān)臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

    [關(guān)鍵詞] 血腦屏障;通透性相關(guān)基因;Caveolin-1;克隆;表達;純化

    [中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2018)11(b)-0013-04

    [Abstract] Objective To clone Caveolin-1, a gene related to human blood-brain barrier permeability, and express it in Escherichia coli. and to purify and identify the protein finally. Methods According to the sequence of Caveolin-1 gene contained in the gene bank, the upstream and downstream primers were designed. The Caveolin-1 double strand was synthesized by PCR and then recombined with pET28a (+) vector. Positive clones were screened and identified by DNA sequence analysis. The constructed recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1 was transfected into E. coli BL21 (DE3), and the expression of the fusion protein was induced by IPTG. The expressed product was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography, identified by SDS-PAGE and Western blot. Results The Caveolin-1 DNA fragment amplified by PCR was identified as human Caveolin-1 gene. The recombinant human Caveolin-1 fusion protein was expressed by IPTG-induced DE3 strain containing the recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1. The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography to obtain a fusion protein of higher purity. Conclusion This study successfully cloned the blood-brain barrier permeability-related gene Caveolin-1, and expressed and purified the protein to obtain a higher purity fusion protein, which laid a foundation for further relevant clinical research.

    [Key words] Blood-brain barrier; Permeability related gene; Caveolin-1; Cloning; Expressing; Purifying

    腦梗死患者多死于腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化,這與腦缺血組織中血腦屏障的受損密切相關(guān)[1]。Caveolins蛋白是小窩的主要結(jié)構(gòu)成份,與小窩的形態(tài)構(gòu)成及相關(guān)功能相關(guān),其家族中包括Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3,其中Caveolin-1分布最為廣泛,且在不同的組織中表達水平不同[2]。Caveolins蛋白家族是血管通透性的重要調(diào)控因子[3-4]。Choi等[5]在《Stroke》雜志中發(fā)表的關(guān)于對鼠缺血性腦損傷模型研究表明,Caveolins家族中,尤其是Caveolin-1蛋白對缺血性損傷時血腦屏障通透性的調(diào)控作用更明顯,與血腦屏障的完整程度存在密切關(guān)系,Caveolin-1蛋白是血腦屏障通透性的重要調(diào)控因子,其可通過調(diào)節(jié)缺血損傷腦組織血腦屏障的通透性,降低水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生,這為臨床腦梗死的治療提供了新思路。理論上,體外操作可實現(xiàn)對腦?;颊呤軗p腦組織中Caveolin-1蛋白的調(diào)控,降低腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生,從而提高腦梗死患者的治愈率并改善其愈后狀況。本研究擬參照葉棋濃[6]在《現(xiàn)代分子生物學技術(shù)與實驗技巧》中所述的研究方法,對人Caveolin-1基因進行克隆,并對其進行蛋白表達,以期獲得高純度的Caveolin-1蛋白,為Caveolin-1治療腦梗死的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菌株和質(zhì)粒pET28a載體、DH5α菌株、大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)、Taq酶、XhoⅠ、EcoRⅠ內(nèi)切酶以及T4連接酶、蛋白Marker均購自TaKaKa公司,質(zhì)粒提取及瓊脂糖凝膠回收試劑盒、鎳離子親和層析(Ni2+-NTA)預(yù)裝柱、化學發(fā)光顯色試劑均購自O(shè)MEGA公司,鼠抗人Anti-6×His抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG均購自浩天生化科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 Caveolin-1基因擴增 根據(jù)Caveolin-1基因序列設(shè)計其上下游引物,并進行PCR反應(yīng),取PCR產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。上下游序列如下:上游引入EcoRⅠ酶切位點,下游引入XhoⅠ酶切位點。正向引物(P1):5′-ACATAAATTTTTTTCTCCAAATTAC-CTGAGTGTCAAGGTGTACGGACCCCTCCGAAGTGT-TAGTACCTCC-3′;反向引物(P2):5′-TATTTTCGAT-GTCTCACTCTGCATGGGGCACTGGGCAGCCACAGA-AGTGAGGGTGCCATTGCTCTGCTTG-3′。PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5 μL,dNTP 4 μL,引物P1 1 μL,引物P2 1 μL,Taq酶0.25 μL,模板2 μL,加水至50 μL。反應(yīng)條件:94℃ 30 s,45℃ 30 s,72℃ 30 s 2個循環(huán),72℃延伸2 h。

    1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的構(gòu)建 將Caveolin-1的PCR產(chǎn)物與pET28a載體DNA分別進行雙酶切,回收純化后進行連接,取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞,涂布于Kan抗性的LB平板上,37℃倒置過夜,次日隨機挑取菌落,接種于Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒,進一步測序鑒定。

    1.2.3 重組人Caveolin-1融合蛋白的誘導表達 用接種環(huán)沾取少量含有重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的保存菌,于LB(Kan+)平板上劃線,37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落,接種于5 mL LB (Kan+)液體培養(yǎng)基,37℃振搖培養(yǎng)過夜。次日取培養(yǎng)過夜菌液500 μL 再接種于50 mL選擇性LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600值達0.6。吸取1 mL后加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),終濃度為1 mmol/L,37℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)4 h。取加IPTG前后的菌液各1 mL,12 000 r/min離心5 min,收集菌體沉淀,并于沉淀中加50 μL蒸餾水,混勻后再加2×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液50 μL,混勻,沸水浴5 min,12 000 r/min離心10 min,每個樣品取20 μL上樣于15%的SDS-PAGE膠上電泳鑒定。

    1.2.4 重組人Caveolin-1融合蛋白的純化及Western blot檢測 將含有重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的LB液體培養(yǎng)基擴大誘導培養(yǎng),提純包涵體,并裂解復性。將復性產(chǎn)物緩慢加于已用磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的Ni2+-NTA親和層析預(yù)裝柱中,加樣所用的流速控制在1 mL/min內(nèi);PBS洗滌除去未結(jié)合蛋白,沖洗流速應(yīng)控制在5 mL/min內(nèi);分別用含100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫融合蛋白,流速5 mL/min。取純化后的融合蛋白20 μL于15%的SDS-PAGE膠上上樣,并電泳;然后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上膜上,進行Western blot印跡分析。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR擴增

    通過Caveolin-1基因上下游引物進行PCR,結(jié)果擴增出一個約700 bp的DNA片段。見圖1。

    2.2 重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1序列分析

    Caveolin-1基因與pET28a(+)載體連接后轉(zhuǎn)入表達菌株DH5α,隨機挑取單克隆菌落,提取質(zhì)粒測序,結(jié)果與Genebank中Caveolin-1序列一致。

    2.3 誘導重組人Caveolin-1融合蛋白的表達

    Caveolin-1的分子量約20.47 KD,pET28a-Caveolin-1表達的Caveolin-1結(jié)果詳見圖2

    2.4 重組融合蛋白的純化、鑒定

    分別采用100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫,并對各洗脫液進行10%的SDS-PAGE電泳鑒定,重組融合蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS緩沖液可以被完全洗脫。見圖3。經(jīng)Western blot印跡分析,可見一清晰條帶,即Caveolin-1蛋白得到有效純化。見圖4。

    3討論

    腦卒中在世界范圍內(nèi)都是引起死亡及致殘的主要原因之一。該領(lǐng)域的研究主要集中于缺血性損傷的細胞,并認為大腦血供不足很容易導致神經(jīng)細胞受損及神經(jīng)功能障礙,多種信號分子參與了這一過程[8-9]。細胞死亡并不是導致疾病的急性期患者死亡的直接原因,大部分腦梗死患者死于腦水腫及在缺血性腦組織中出現(xiàn)的出血性轉(zhuǎn)化。腦水腫可引起缺血性梗阻面積的擴大,并可通過一系列反應(yīng)引發(fā)臨床癥狀的惡化。出血性轉(zhuǎn)化是公認的腦梗死伴發(fā)癥,其生理的特殊性限制了溶栓療法的臨床應(yīng)用,進而導致腦梗死死亡的發(fā)生。腦梗死患者出現(xiàn)腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的嚴重后果是由血腦屏障的破壞而引起的[10]。維持血管完整性是腦缺血治療的靶標。然而,在臨床中維持血腦屏障完整性的治療是有限的。因此,了解血腦屏障破壞的潛在機制對腦卒中的治療及預(yù)后有重要意義。

    Caveolins-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)參與調(diào)控血腦屏障滲出、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)炎性反應(yīng)過程,還參與了髓鞘修復和神經(jīng)元突觸再生等過程[11-12]。在腦缺血急性期,Caveolins-1過表達能夠降低血腦屏障滲透性、減輕腦水腫,進而減小腦梗死體積,發(fā)揮腦保護作用[13-14]。鐘義良等[15]的研究表明,血清Caveolins-1水平可作為急性腦梗死發(fā)生早期神經(jīng)功能惡化的獨立預(yù)測因子。膜蛋白Caveolins是調(diào)控血管通透性的關(guān)鍵因子[4,16]。Caveolin-1是小窩蛋白的一種,這個家族是細胞膜的重要組成成份,是細胞膜表面小窩的標記蛋白[17],其作為支架蛋白可結(jié)合信號分子調(diào)控細胞膜的穩(wěn)定性,參與信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞增殖等活動[18-20]。Choi等[13]研究表明,Caveolins家族中的Caveolins-1可通過阻止緊密連接蛋白的降解,抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來保護細胞膜的完整。降低腦缺血損傷時Caveolins-1的表達,對血腦屏障的通透性是有害的;增加腦缺血損傷時Caveolins-1的表達可保護血腦屏障的通透性,減少腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。Caveolins-1是可維持血腦屏障通透性穩(wěn)定的蛋白,可以作為治療腦梗死的靶標。未來有望通過體外調(diào)控缺血腦組織中Caveolins-1基因及其蛋白的表達,降低腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生,進而提高腦梗死患者的治愈率、改善其愈后狀況。

    本研究依據(jù)基因庫中公布的Caveolins-1序列,自行設(shè)計了Caveolins-1基因的上游及下游引物片段,并對該基因進行了PCR,得到了Caveolins-1的PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)純化后與pET28a(+)載體連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Caveolins-1,轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α,培養(yǎng)后挑取的單克隆菌落經(jīng)序列分析后確定重組片段為人血腦屏障通透性相關(guān)的Caveolin-1基因全長cDNA。經(jīng)IPTG誘導的含有pET28a-Caveolin-1重組質(zhì)粒的DE3菌,表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA親和層析進行純化后,得到了較高純度的融合Caveolins-1蛋白。這為今后Caveolins-1治療腦梗死的研究奠定了基礎(chǔ)。

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    (收稿日期:2017-12-08 本文編輯:任 念)

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