• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin—1的克隆及其蛋白表達、純化

    2018-12-22 09:34招樹濤徐永健陳浩云
    中國醫(yī)藥導報 2018年32期
    關(guān)鍵詞:通透性出血性腦水腫

    招樹濤 徐永健 陳浩云

    [摘要] 目的 克隆與人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin-1,并在大腸埃希菌中表達,最后進行蛋白純化、鑒定。方法 根據(jù)基因庫中收錄的Caveolin-1基因序列,設(shè)計其上下游引物,經(jīng)過PCR反應(yīng)合成Caveolin-1雙鏈,然后與pET28a(+)載體重組,篩選陽性克隆并對DNA序列分析鑒定。將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1轉(zhuǎn)入化大腸埃希菌BL21(DE3),異丙基硫代半乳糖苷誘導融合蛋白表達,表達產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析(Ni2+-NTA)純化,SDS-PAGE檢測和Western blot鑒定。 結(jié)果 PCR擴增的Caveolin-1 DNA片段經(jīng)鑒定確認為人Caveolin-1基因。經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導的含有pET28a-Caveolin-1重組質(zhì)粒的DE3菌表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化,獲得了較高純度的融合蛋白。 結(jié)論 本研究成功克隆了人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin-1,并對其進行蛋白表達、純化,獲得了較高純度融合蛋白,為進一步的相關(guān)臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

    [關(guān)鍵詞] 血腦屏障;通透性相關(guān)基因;Caveolin-1;克隆;表達;純化

    [中圖分類號] R543.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2018)11(b)-0013-04

    [Abstract] Objective To clone Caveolin-1, a gene related to human blood-brain barrier permeability, and express it in Escherichia coli. and to purify and identify the protein finally. Methods According to the sequence of Caveolin-1 gene contained in the gene bank, the upstream and downstream primers were designed. The Caveolin-1 double strand was synthesized by PCR and then recombined with pET28a (+) vector. Positive clones were screened and identified by DNA sequence analysis. The constructed recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1 was transfected into E. coli BL21 (DE3), and the expression of the fusion protein was induced by IPTG. The expressed product was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography, identified by SDS-PAGE and Western blot. Results The Caveolin-1 DNA fragment amplified by PCR was identified as human Caveolin-1 gene. The recombinant human Caveolin-1 fusion protein was expressed by IPTG-induced DE3 strain containing the recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1. The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography to obtain a fusion protein of higher purity. Conclusion This study successfully cloned the blood-brain barrier permeability-related gene Caveolin-1, and expressed and purified the protein to obtain a higher purity fusion protein, which laid a foundation for further relevant clinical research.

    [Key words] Blood-brain barrier; Permeability related gene; Caveolin-1; Cloning; Expressing; Purifying

    腦梗死患者多死于腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化,這與腦缺血組織中血腦屏障的受損密切相關(guān)[1]。Caveolins蛋白是小窩的主要結(jié)構(gòu)成份,與小窩的形態(tài)構(gòu)成及相關(guān)功能相關(guān),其家族中包括Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3,其中Caveolin-1分布最為廣泛,且在不同的組織中表達水平不同[2]。Caveolins蛋白家族是血管通透性的重要調(diào)控因子[3-4]。Choi等[5]在《Stroke》雜志中發(fā)表的關(guān)于對鼠缺血性腦損傷模型研究表明,Caveolins家族中,尤其是Caveolin-1蛋白對缺血性損傷時血腦屏障通透性的調(diào)控作用更明顯,與血腦屏障的完整程度存在密切關(guān)系,Caveolin-1蛋白是血腦屏障通透性的重要調(diào)控因子,其可通過調(diào)節(jié)缺血損傷腦組織血腦屏障的通透性,降低水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生,這為臨床腦梗死的治療提供了新思路。理論上,體外操作可實現(xiàn)對腦?;颊呤軗p腦組織中Caveolin-1蛋白的調(diào)控,降低腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生,從而提高腦梗死患者的治愈率并改善其愈后狀況。本研究擬參照葉棋濃[6]在《現(xiàn)代分子生物學技術(shù)與實驗技巧》中所述的研究方法,對人Caveolin-1基因進行克隆,并對其進行蛋白表達,以期獲得高純度的Caveolin-1蛋白,為Caveolin-1治療腦梗死的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菌株和質(zhì)粒pET28a載體、DH5α菌株、大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)、Taq酶、XhoⅠ、EcoRⅠ內(nèi)切酶以及T4連接酶、蛋白Marker均購自TaKaKa公司,質(zhì)粒提取及瓊脂糖凝膠回收試劑盒、鎳離子親和層析(Ni2+-NTA)預(yù)裝柱、化學發(fā)光顯色試劑均購自O(shè)MEGA公司,鼠抗人Anti-6×His抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG均購自浩天生化科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 Caveolin-1基因擴增 根據(jù)Caveolin-1基因序列設(shè)計其上下游引物,并進行PCR反應(yīng),取PCR產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。上下游序列如下:上游引入EcoRⅠ酶切位點,下游引入XhoⅠ酶切位點。正向引物(P1):5′-ACATAAATTTTTTTCTCCAAATTAC-CTGAGTGTCAAGGTGTACGGACCCCTCCGAAGTGT-TAGTACCTCC-3′;反向引物(P2):5′-TATTTTCGAT-GTCTCACTCTGCATGGGGCACTGGGCAGCCACAGA-AGTGAGGGTGCCATTGCTCTGCTTG-3′。PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5 μL,dNTP 4 μL,引物P1 1 μL,引物P2 1 μL,Taq酶0.25 μL,模板2 μL,加水至50 μL。反應(yīng)條件:94℃ 30 s,45℃ 30 s,72℃ 30 s 2個循環(huán),72℃延伸2 h。

    1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的構(gòu)建 將Caveolin-1的PCR產(chǎn)物與pET28a載體DNA分別進行雙酶切,回收純化后進行連接,取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞,涂布于Kan抗性的LB平板上,37℃倒置過夜,次日隨機挑取菌落,接種于Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒,進一步測序鑒定。

    1.2.3 重組人Caveolin-1融合蛋白的誘導表達 用接種環(huán)沾取少量含有重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的保存菌,于LB(Kan+)平板上劃線,37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落,接種于5 mL LB (Kan+)液體培養(yǎng)基,37℃振搖培養(yǎng)過夜。次日取培養(yǎng)過夜菌液500 μL 再接種于50 mL選擇性LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600值達0.6。吸取1 mL后加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),終濃度為1 mmol/L,37℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)4 h。取加IPTG前后的菌液各1 mL,12 000 r/min離心5 min,收集菌體沉淀,并于沉淀中加50 μL蒸餾水,混勻后再加2×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液50 μL,混勻,沸水浴5 min,12 000 r/min離心10 min,每個樣品取20 μL上樣于15%的SDS-PAGE膠上電泳鑒定。

    1.2.4 重組人Caveolin-1融合蛋白的純化及Western blot檢測 將含有重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的LB液體培養(yǎng)基擴大誘導培養(yǎng),提純包涵體,并裂解復性。將復性產(chǎn)物緩慢加于已用磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的Ni2+-NTA親和層析預(yù)裝柱中,加樣所用的流速控制在1 mL/min內(nèi);PBS洗滌除去未結(jié)合蛋白,沖洗流速應(yīng)控制在5 mL/min內(nèi);分別用含100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫融合蛋白,流速5 mL/min。取純化后的融合蛋白20 μL于15%的SDS-PAGE膠上上樣,并電泳;然后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上膜上,進行Western blot印跡分析。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR擴增

    通過Caveolin-1基因上下游引物進行PCR,結(jié)果擴增出一個約700 bp的DNA片段。見圖1。

    2.2 重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1序列分析

    Caveolin-1基因與pET28a(+)載體連接后轉(zhuǎn)入表達菌株DH5α,隨機挑取單克隆菌落,提取質(zhì)粒測序,結(jié)果與Genebank中Caveolin-1序列一致。

    2.3 誘導重組人Caveolin-1融合蛋白的表達

    Caveolin-1的分子量約20.47 KD,pET28a-Caveolin-1表達的Caveolin-1結(jié)果詳見圖2

    2.4 重組融合蛋白的純化、鑒定

    分別采用100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫,并對各洗脫液進行10%的SDS-PAGE電泳鑒定,重組融合蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS緩沖液可以被完全洗脫。見圖3。經(jīng)Western blot印跡分析,可見一清晰條帶,即Caveolin-1蛋白得到有效純化。見圖4。

    3討論

    腦卒中在世界范圍內(nèi)都是引起死亡及致殘的主要原因之一。該領(lǐng)域的研究主要集中于缺血性損傷的細胞,并認為大腦血供不足很容易導致神經(jīng)細胞受損及神經(jīng)功能障礙,多種信號分子參與了這一過程[8-9]。細胞死亡并不是導致疾病的急性期患者死亡的直接原因,大部分腦梗死患者死于腦水腫及在缺血性腦組織中出現(xiàn)的出血性轉(zhuǎn)化。腦水腫可引起缺血性梗阻面積的擴大,并可通過一系列反應(yīng)引發(fā)臨床癥狀的惡化。出血性轉(zhuǎn)化是公認的腦梗死伴發(fā)癥,其生理的特殊性限制了溶栓療法的臨床應(yīng)用,進而導致腦梗死死亡的發(fā)生。腦梗死患者出現(xiàn)腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的嚴重后果是由血腦屏障的破壞而引起的[10]。維持血管完整性是腦缺血治療的靶標。然而,在臨床中維持血腦屏障完整性的治療是有限的。因此,了解血腦屏障破壞的潛在機制對腦卒中的治療及預(yù)后有重要意義。

    Caveolins-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)參與調(diào)控血腦屏障滲出、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)炎性反應(yīng)過程,還參與了髓鞘修復和神經(jīng)元突觸再生等過程[11-12]。在腦缺血急性期,Caveolins-1過表達能夠降低血腦屏障滲透性、減輕腦水腫,進而減小腦梗死體積,發(fā)揮腦保護作用[13-14]。鐘義良等[15]的研究表明,血清Caveolins-1水平可作為急性腦梗死發(fā)生早期神經(jīng)功能惡化的獨立預(yù)測因子。膜蛋白Caveolins是調(diào)控血管通透性的關(guān)鍵因子[4,16]。Caveolin-1是小窩蛋白的一種,這個家族是細胞膜的重要組成成份,是細胞膜表面小窩的標記蛋白[17],其作為支架蛋白可結(jié)合信號分子調(diào)控細胞膜的穩(wěn)定性,參與信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞增殖等活動[18-20]。Choi等[13]研究表明,Caveolins家族中的Caveolins-1可通過阻止緊密連接蛋白的降解,抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來保護細胞膜的完整。降低腦缺血損傷時Caveolins-1的表達,對血腦屏障的通透性是有害的;增加腦缺血損傷時Caveolins-1的表達可保護血腦屏障的通透性,減少腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。Caveolins-1是可維持血腦屏障通透性穩(wěn)定的蛋白,可以作為治療腦梗死的靶標。未來有望通過體外調(diào)控缺血腦組織中Caveolins-1基因及其蛋白的表達,降低腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生,進而提高腦梗死患者的治愈率、改善其愈后狀況。

    本研究依據(jù)基因庫中公布的Caveolins-1序列,自行設(shè)計了Caveolins-1基因的上游及下游引物片段,并對該基因進行了PCR,得到了Caveolins-1的PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)純化后與pET28a(+)載體連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Caveolins-1,轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α,培養(yǎng)后挑取的單克隆菌落經(jīng)序列分析后確定重組片段為人血腦屏障通透性相關(guān)的Caveolin-1基因全長cDNA。經(jīng)IPTG誘導的含有pET28a-Caveolin-1重組質(zhì)粒的DE3菌,表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA親和層析進行純化后,得到了較高純度的融合Caveolins-1蛋白。這為今后Caveolins-1治療腦梗死的研究奠定了基礎(chǔ)。

    [參考文獻]

    [1] Jian LK,Rosenberg GA. Matrix metalloproteinases and free radicals in cerebral ischemia [J]. Free Radic Biol Med,2005,39(4):71-80.

    [2] Parton RG,Simons K. The multiple faces of caveolae [J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(6):185-194.

    [3] Song L,Ge S,Pachter JS. Caveolin-1 regulates expression of junctionassociatedproteins in brain microvascular endothelial cells [J]. Blood,2007,109(8):1515-1523.

    [4] élizabeth Beauchesne,Desjardins P,Butterworth RF,et al. Up-regulation of caveolin-1 and blood-brain barrier breakdown are attenuated by N-acetylcysteine in thiamine deficiency [J]. Neurochem Int,2010,57(7):830-837.

    [5] Choi KH,Kim HS,Park MS,et al. Regulation of Caveolin-1 expression determines early brain edema after experimental focal cerebral ischemia [J]. Stroke,2016,5(3):1336-1343.

    [6] 葉棋濃.現(xiàn)代分子生物學技術(shù)與實驗技巧[M].北京:化學工業(yè)出版社,2015.

    [7] Janyou A,Wicha P,Jittiwat J,et al. Dihydrocapsaicin attenuates attenuates blood brain barrier and cerebral damage in focal cerebral ischemia/reperfusion via oxidative stress and inflammatory [J]. Sci Rep,2017,7(1):10 556.

    [8] Frieler RA,Chung Y,Ahlers CG,et al. Genetic neutrophil deficiency ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury [J]. Exp Neurol,2017,S0014-4886(17):30 222-30 224.

    [9] Su J,Liu J,Yan XY,et al. Cytoprotective effect of the UCP2-SIRT3 signaling pathway by decreasing mitochondrial oxidative stress on cerebral ischemia-reperfusion injury [J]. Int J Mol Sci,2017,18(7):E1599.

    [10] Jian LK,Rosenberg GA. Matrix metalloproteinases and free radicals in cerebral ischemia [J]. Free Radic Biol Med,2005,39(11):71-80.

    [11] Zhao YL,Song JN,Zhang M. Role of caveolin-1 in the biology of the blood-brain barrier [J]. Rev Neurosci,2014, 25(2):247-254.

    [12] Mandyam CD,Schilling JM,Cui W,et al. Neuron-targeted caveolin-1 improves molecular signaling, plasticity, and behavior dependent on the hippocampus in adult and aged mice [J]. Biol Psychiatry,2017, 81(2):101-110.

    [13] Choi KH,Kim HS,Park MS,et al. Overexpression of caveolin-1 attenuates brain edema by inhibiting tight junction degradation [J]. Oncotarget,2016,7(42):67 857-67 867.

    [14] Nag S,Manias JL,Kapadia A,et al. Molecular changes associated with the protective effects of angiopoietin-1 during blood-brain barrier breakdown postinjury [J]. Mol Neurobiol,2017,54(6):4232-4242.

    [15] 鐘義良,張融融,黃思源,等.急性腦梗死患者血清陷窩蛋白1水平與早期神經(jīng)功能惡化的關(guān)系[J].上海交通大學學報:醫(yī)學版,2017,37(12):1678-1681.

    [16] Han F,Zhu HG. Caveolin-1 regulating the invasion and expression of matrix metalloproteinase (MMPs) in pancreatic carcinoma cells [J]. J Surg Res,2010,159(1):443-450.

    [17] Gu X,Reagan AM,McClellan ME,et al. Caveolins and caveolae in ocular physiology and pathophysiology [J]. Prog Retin Eye Res,2017(56):84-106.

    [18] Kovtun O,Tillu VA,Jung W,et al. Structural insights into the organization of the cavin membrane coat complex [J]. DevCell,2014,31(4):405-419.

    [19] Busija AR,Patel HH,Insel PA,et al. Caveolins and cavins in the trafficking,maturation,and degradation of caveolae:implications for cell physiology [J]. Am J Physiol Cell Physiol,2017,312(4):C459-C477.

    [20] Grzegorz S. Caveolae,caveolins,cavins,and endothelial cell function:new insights [J]. Frontiers in Physiology,2011, 2(2):120.

    (收稿日期:2017-12-08 本文編輯:任 念)

    猜你喜歡
    通透性出血性腦水腫
    腦出血并腦水腫患者行甘油果糖聯(lián)合甘露醇治療的效果
    甲基苯丙胺對大鼠心臟血管通透性的影響初探
    聯(lián)用吡拉西坦與甘露醇對腦出血所致腦水腫患者進行治療的效果分析
    紅景天苷對氯氣暴露致急性肺損傷肺血管通透性的保護作用
    庫爾勒市三例奶牛出血性乳房炎的診治
    院前嚴重創(chuàng)傷出血性休克患者兩種液體復蘇分析
    吡拉西坦注射液聯(lián)合甘露醇治療腦出血后腦水腫的療效觀察
    豬殺菌/通透性增加蛋白基因siRNA載體構(gòu)建及干擾效果評價
    經(jīng)血管介入治療出血性疾病的臨床研究
    依達拉奉治療急性腦出血后腦水腫及自由基的變化
    国产精品久久久久成人av| 正在播放国产对白刺激| 香蕉丝袜av| 91字幕亚洲| 国产精品熟女久久久久浪| 精品国内亚洲2022精品成人 | 91老司机精品| 午夜免费鲁丝| 亚洲免费av在线视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 少妇精品久久久久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 美女高潮到喷水免费观看| 天堂中文最新版在线下载| 国产又爽黄色视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 1024香蕉在线观看| av视频免费观看在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 一区二区日韩欧美中文字幕| 男女无遮挡免费网站观看| avwww免费| 在线永久观看黄色视频| 午夜免费成人在线视频| 日本91视频免费播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩视频在线欧美| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产有黄有色有爽视频| 乱人伦中国视频| e午夜精品久久久久久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜成年电影在线免费观看| 成人免费观看视频高清| 超碰成人久久| av网站免费在线观看视频| 精品欧美一区二区三区在线| 在线观看免费午夜福利视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 大香蕉久久网| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日本a在线网址| 自线自在国产av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 婷婷色av中文字幕| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91字幕亚洲| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久国产欧美日韩av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久亚洲精品不卡| 蜜桃在线观看..| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美激情高清一区二区三区| 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产不卡av网站在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 五月天丁香电影| 又紧又爽又黄一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 自线自在国产av| 日本欧美视频一区| 考比视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频 | 在线看a的网站| 91国产中文字幕| 国产成人av教育| 老司机午夜福利在线观看视频 | a级毛片在线看网站| 1024视频免费在线观看| 99香蕉大伊视频| 精品国产一区二区久久| 两人在一起打扑克的视频| 成人三级做爰电影| 国产精品一区二区在线不卡| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲av成人一区二区三| 不卡av一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 久久精品国产a三级三级三级| 国产xxxxx性猛交| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩视频一区二区在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 最近最新免费中文字幕在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 两人在一起打扑克的视频| 久久ye,这里只有精品| 精品久久久精品久久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产亚洲精品第一综合不卡| 18禁国产床啪视频网站| 国产三级黄色录像| 国产成人精品无人区| 久久精品成人免费网站| 亚洲免费av在线视频| 9色porny在线观看| 无限看片的www在线观看| 不卡一级毛片| 欧美日韩黄片免| videos熟女内射| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产有黄有色有爽视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国精品久久久久久国模美| 水蜜桃什么品种好| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久国内视频| 国产区一区二久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 97精品久久久久久久久久精品| 午夜免费成人在线视频| 亚洲第一青青草原| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 黄片大片在线免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 看免费av毛片| 老司机在亚洲福利影院| 男人舔女人的私密视频| kizo精华| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人手机av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲 欧美一区二区三区| netflix在线观看网站| 不卡一级毛片| 欧美97在线视频| videosex国产| 久久免费观看电影| 日韩大片免费观看网站| 一级毛片女人18水好多| 国产老妇伦熟女老妇高清| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| videosex国产| 男女下面插进去视频免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 操出白浆在线播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品影院久久| 男女床上黄色一级片免费看| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久国产成人免费| av一本久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 飞空精品影院首页| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费在线观看日本一区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久香蕉激情| 国精品久久久久久国模美| 蜜桃国产av成人99| 亚洲国产看品久久| 性色av乱码一区二区三区2| 99久久国产精品久久久| 久久热在线av| 午夜激情av网站| 久9热在线精品视频| 人成视频在线观看免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久久久久久精品精品| 老司机影院成人| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av网站在线播放免费| 国产av国产精品国产| 亚洲中文字幕日韩| 欧美黑人精品巨大| 日韩欧美免费精品| 精品国产一区二区久久| √禁漫天堂资源中文www| 99国产精品一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 老司机午夜十八禁免费视频| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 久久久久网色| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲男人天堂网一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 美女福利国产在线| 老司机靠b影院| 黄片小视频在线播放| 欧美xxⅹ黑人| 国产97色在线日韩免费| 国产免费视频播放在线视频| 蜜桃国产av成人99| 久久天堂一区二区三区四区| 国产福利在线免费观看视频| 少妇的丰满在线观看| 咕卡用的链子| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 777米奇影视久久| 99久久综合免费| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 十八禁人妻一区二区| 正在播放国产对白刺激| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲第一av免费看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲免费av在线视频| 一本久久精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 99国产精品免费福利视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜久久久在线观看| 在线观看舔阴道视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 视频区欧美日本亚洲| 99久久国产精品久久久| 色视频在线一区二区三区| 美女视频免费永久观看网站| a级片在线免费高清观看视频| 又大又爽又粗| 久久国产精品人妻蜜桃| 一级a爱视频在线免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 91国产中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人av教育| 99九九在线精品视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 大陆偷拍与自拍| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品一二三区在线看| www.999成人在线观看| 亚洲天堂av无毛| 久久青草综合色| 久久久久久人人人人人| www.av在线官网国产| 制服诱惑二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品一二三区在线看| 十八禁网站免费在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 伦理电影免费视频| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲视频免费观看视频| 在线看a的网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美性长视频在线观看| av在线老鸭窝| 亚洲七黄色美女视频| av一本久久久久| 动漫黄色视频在线观看| av有码第一页| 在线av久久热| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 黄频高清免费视频| 午夜激情久久久久久久| 9热在线视频观看99| 精品一区二区三卡| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产一区二区 视频在线| 成人av一区二区三区在线看 | 我的亚洲天堂| 蜜桃国产av成人99| 国产三级黄色录像| 国产成人免费观看mmmm| 欧美性长视频在线观看| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品自拍成人| www.熟女人妻精品国产| 国产视频一区二区在线看| 黄片小视频在线播放| 国产色视频综合| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 黄色怎么调成土黄色| 91字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜制服| 日本vs欧美在线观看视频| 国产亚洲精品一区二区www | 他把我摸到了高潮在线观看 | 国产熟女午夜一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品 国内视频| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产高清国产精品国产三级| 91字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜制服| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产成人一精品久久久| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久久久精品精品| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 色视频在线一区二区三区| 一个人免费看片子| 久久精品亚洲av国产电影网| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美黑人精品巨大| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品第二区| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产成人a∨麻豆精品| 久久狼人影院| 操出白浆在线播放| 欧美日韩av久久| 欧美激情极品国产一区二区三区| 91麻豆av在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 人成视频在线观看免费观看| av在线播放精品| 日本欧美视频一区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 我要看黄色一级片免费的| 国产日韩欧美在线精品| 成人手机av| 一本综合久久免费| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲国产av新网站| 一级a爱视频在线免费观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲精品在线美女| 久久人妻福利社区极品人妻图片| www.熟女人妻精品国产| 成年av动漫网址| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 真人做人爱边吃奶动态| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品国产一区二区久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 91精品国产国语对白视频| avwww免费| 99久久国产精品久久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 视频区欧美日本亚洲| av一本久久久久| videos熟女内射| 色精品久久人妻99蜜桃| 91精品伊人久久大香线蕉| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 91大片在线观看| 久久久久久久国产电影| 国产成人精品久久二区二区91| 国产av国产精品国产| 日韩电影二区| 一进一出抽搐动态| 国产精品1区2区在线观看. | av国产精品久久久久影院| 欧美97在线视频| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲五月色婷婷综合| 最近中文字幕2019免费版| 精品一区二区三区av网在线观看 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久久国内视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 爱豆传媒免费全集在线观看| 飞空精品影院首页| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲国产av新网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄色视频,在线免费观看| 黄片播放在线免费| 亚洲第一av免费看| 视频区图区小说| 久久久久国产精品人妻一区二区| 99精国产麻豆久久婷婷| 淫妇啪啪啪对白视频 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 色播在线永久视频| 亚洲国产精品999| 国产欧美日韩一区二区精品| av免费在线观看网站| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美大码av| 欧美97在线视频| 少妇人妻久久综合中文| 99热全是精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人a∨麻豆精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 人妻久久中文字幕网| 亚洲全国av大片| 免费人妻精品一区二区三区视频| 在线 av 中文字幕| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜福利在线免费观看网站| 久久综合国产亚洲精品| 美女中出高潮动态图| 99热网站在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 最近最新免费中文字幕在线| 高清欧美精品videossex| 国产精品.久久久| 人人澡人人妻人| 男人添女人高潮全过程视频| 一区二区av电影网| 另类精品久久| 一级片免费观看大全| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 国产亚洲av高清不卡| 男女免费视频国产| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人欧美| 久久性视频一级片| 在线观看免费高清a一片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲国产av影院在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 热99国产精品久久久久久7| 大陆偷拍与自拍| 91精品国产国语对白视频| www.999成人在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 一级片免费观看大全| 国产精品熟女久久久久浪| 国产av精品麻豆| 国产免费视频播放在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美97在线视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 精品福利观看| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 激情视频va一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 免费日韩欧美在线观看| 成在线人永久免费视频| av在线播放精品| 91精品三级在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美黑人精品巨大| √禁漫天堂资源中文www| 日韩电影二区| 大码成人一级视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲少妇的诱惑av| 免费不卡黄色视频| av线在线观看网站| 操出白浆在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久香蕉激情| 久久久久久人人人人人| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩免费高清中文字幕av| 黄色视频,在线免费观看| netflix在线观看网站| 午夜福利免费观看在线| 大片免费播放器 马上看| 国产成人精品在线电影| 丝袜美足系列| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩视频一区二区在线观看| 精品少妇内射三级| 国产在线免费精品| 日日夜夜操网爽| 日韩三级视频一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久精品人妻al黑| 脱女人内裤的视频| 国产欧美亚洲国产| 黄色毛片三级朝国网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久国产精品麻豆| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜福利免费观看在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品免费视频内射| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久热爱精品视频在线9| 亚洲人成电影观看| 999久久久精品免费观看国产| 波多野结衣一区麻豆| 三上悠亚av全集在线观看| av福利片在线| 自线自在国产av| 成人国产av品久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜老司机福利片| 久久精品国产a三级三级三级| 操出白浆在线播放| 男女午夜视频在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品国产一区二区三区四区第35| 午夜激情久久久久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产片内射在线| 国产在线视频一区二区| 中文字幕高清在线视频| videosex国产| 亚洲专区字幕在线| 欧美在线一区亚洲| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲五月婷婷丁香| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日本五十路高清| 老司机福利观看| av视频免费观看在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久 成人 亚洲| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美日韩精品网址| 成人手机av| 好男人电影高清在线观看| 国产一区二区在线观看av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久天堂一区二区三区四区| 精品第一国产精品| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 99九九在线精品视频| 大型av网站在线播放| 久热爱精品视频在线9| 制服诱惑二区| 91字幕亚洲| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品国产av在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一本久久精品| 天天操日日干夜夜撸| 另类精品久久| 国产一区二区在线观看av| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人欧美在线观看 | 大香蕉久久成人网| 另类精品久久| 视频区图区小说| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 麻豆av在线久日| 狂野欧美激情性bbbbbb| 波多野结衣一区麻豆| 丁香六月天网| 高清在线国产一区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成+人综合+亚洲专区| av超薄肉色丝袜交足视频| 成人av一区二区三区在线看 | 午夜免费成人在线视频| 777米奇影视久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频|