利用酵母雙雜交技術(shù)篩選炭疽菌中與CsSSK1相互作用的蛋白質(zhì)

方思齊 李澤棟 王記圓 何其光 李瀟 劉文波 張宇 林春花 繆衛(wèi)國

摘? 要：炭疽菌（Colletotrichum siamense）是橡膠樹等多種熱帶作物炭疽病的主要病原。雙組分系統(tǒng)（two component system）在病原真菌中參與菌體對外界環(huán)境變化的適應(yīng)、耐藥性和毒力的調(diào)控。該系統(tǒng)包括感受器和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，SSK1（SLF-interacting SKP1-like1）是雙組分系統(tǒng)中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。為了了解炭疽菌中SSK1互作蛋白，本研究克隆獲得橡膠樹炭疽菌的一個應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白編碼基因CsSSK1，大小為2750 bp，cDNA大小為2190 bp，編碼729個氨基酸，包含1個內(nèi)含子，具有1個cheY同系物接收結(jié)構(gòu)域和10個復(fù)雜結(jié)構(gòu)。并利用酵母雙雜交技術(shù)，在橡膠樹炭疽菌cDNA文庫中對CsSSK1互作蛋白進行篩選，共篩選到10個互作蛋白，分別為轉(zhuǎn)酮醇酶、金屬內(nèi)酰胺酶、鋅乙醇脫氫酶、泛素亞型X1、微管蛋白以及5個未知或假定蛋白。該結(jié)果為進一步研究CsSSK1的功能、互作蛋白及調(diào)節(jié)機制提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹炭疽菌;雙組分系統(tǒng);應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白SSK1;互作蛋白

中圖分類號：S763.7? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： Colletotrichum siamense is the main pathogen of anthracnose of rubber tree or other tropical crops. A two component system is involved in the adaptation of fungi to external environmental changes， drug resistance and virulence in pathogenic fungi. In pathogenic fungi， it includes receptors and SSK1 （SLF-interacting SKP1-like1） response regulatory protein components. To obtain proteins interacting with SSK1 in C. siamense， a homologue gene CsSSK1， 2750 bp long with cDNA 2190 bp， was cloned. It contained a cheY homologs receiving domains and 10 complex structures. Then the pGBKT7-CsSSK1 vector was constructed. By an yeast two hybrid system， ten proteins， including transketolase， β-lactamase， alcohol dehydrogenase， ubiquitin， tubulin and 5 unknown or hypothetical proteins， maight interacting with CsSSK1， were identified after sequencing and bioinformatics analysis. This result would provide a basis for further study of the functions， interaction proteins and regulatory mechanism of CsSSK1.

Keywords： Colletotrichum siamense; two component system; response regulatory protein SSK1; interaction protein

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.027

雙組分系統(tǒng)（two-component signaling system， TCS）是廣泛存在于細菌、真菌、粘菌及高等植物的一類信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[1]。在病原真菌中，該途徑參與細胞新陳代謝和生理生化過程，包括細胞能動性、細胞周期的控制、發(fā)育、對脅迫的耐受性、以及致病細菌和真菌的致病性過程等[1]。真核生物的雙組分系統(tǒng)通常由3個部分組成：組氨酸激酶（histidine kinase， HK）、組氨酸基團的磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（HPt）、應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（response regulator， RR）[2]。例如，模式生物酵母的雙組分系統(tǒng)由Sln1-Ypd1-Ssk1組成，Sln1作為雜合型組氨酸激酶感受器（HK），需要Ypd1（HPt）和Ssk1（RR）來繼續(xù)磷酸基團的轉(zhuǎn)移[3]。已有研究證明雙組分信號系統(tǒng)對于病原真菌Aspergillus fumigatus、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Blastomyces dermatitidis和Histoplasma capsulatum的毒性和抗藥性的重要性[4]。

SSK1作為雙組分系統(tǒng)中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（RR），在真核細胞中充當(dāng)接受和傳遞信號的功能，即將雙組分系統(tǒng)中的磷酸基團從Ypd1p轉(zhuǎn)移至下游HOG MAPK（high-osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase）途徑中的MAPKKK（mitogen-activated protein kinase kinase kinase）的角色[5-7]。HOG MAPK信號途徑在真菌誘導(dǎo)脅迫反應(yīng)、信息素反應(yīng)、細胞形態(tài)恢復(fù)、致病性和抗藥性等方面都起著重要作用[8-9]。該信號途徑主要由MAPK（Hog1p）、MAPKK（Pbs2p）、和MAPKKK（Ste11p，Ssk2p和Ssk22p）組成[8]。已有研究顯示，SSK1與病原菌的毒力和對各種脅迫的反應(yīng)有關(guān)。例如，在稻瘟病病原Pyricularia oryzae中，雙組分系統(tǒng)2個RR基因（MoSSK1和MoSKN7）共同調(diào)控稻瘟菌對于滲透壓和咯菌腈的敏感性，還參與病原毒性[1， 9-10]，在病原真菌Botrytis cinerea中的SSK1與毒性相關(guān)[10];Beauveria bassiana的SSK1也與病原菌毒力和對滲透壓的抗性相關(guān)[11]。但也有研究報道SSK1在不同真菌中功能有差異，如在Kluyveromyces lactis中，SSK1缺失后，突變體對高滲透壓的敏感性沒有發(fā)生改變[12]，然而，在Candida albicans中，SSK1缺失突變體比野生型對高鹽具有更高的敏感性[4]。在Vertilillium dahliae中，該基因還與病原菌的壓力脅迫反應(yīng)、黑色素的合成和致病力相關(guān)[13]。

橡膠樹炭疽病是橡膠樹葉部的重要病害，炭疽菌（Colletotrichum siamense）是我國橡膠樹炭疽病的主要病原種類[14-15]，也是熱帶作物炭疽病的主要病原種類[16]。項目組前期研究顯示橡膠樹炭疽菌HOG MAPK途徑參與調(diào)控菌體對滲透壓和咯菌腈敏感性的功能[17];已有研究表明：SSK1作為傳遞信號至HOG MAPK途徑的角色，且也參與了病原真菌在壓力脅迫、藥劑敏感性、菌體毒性類似功能[1， 9-12]。二者存在何種關(guān)系？SSK1在菌體內(nèi)是否有其他互作蛋白？是否調(diào)控其他蛋白的功能等方面知之甚少?；谇捌谝呀?jīng)構(gòu)建了橡膠樹的炭疽菌（C. siamense）cDNA酵母文庫的基礎(chǔ)上，本研究克隆獲得炭疽菌SSK1同源基因CsSSK1基因，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-CsSSK1，利用酵母雙雜交技術(shù)從橡膠樹炭疽菌cDNA文庫中篩選互作蛋白，該研究結(jié)果可為進一步了解CsSSK1的互作蛋白及功能，了解真菌雙組分系統(tǒng)的功能，以及菌體在壓力脅迫、藥劑敏感性、菌體毒性的調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株及質(zhì)粒? 橡膠樹炭疽菌（C. siamense）HN08菌株分離自海南省瓊中新進農(nóng)場橡膠樹病葉，由本實驗室分離鑒定保存[15];大腸桿菌Escherichia coli DH5α和載體PMD-18T購自大連TaKaRa公司;酵母感受態(tài)細胞（Y2HGold Chemically Competent Cell）購自于上海唯地生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒pGADT7、pGBKT7由本實驗室保存。橡膠樹炭疽菌酵母雙雜交cDNA文庫由本實驗室構(gòu)建保存。

1.1.2? 試劑? 限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ，BamHⅠ）購自寶生物工程（大連）有限公司;植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）購自天根生化科技（北京）有限公司;凝膠DNA小量回收試劑盒（Hipure Gel pure DNA Mini Kit）購自海南立菲特生物科技有限公司;高保真DNA聚合酶、蛋白質(zhì)Marker、DNA Marker、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒One-step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司;T4 DNA連接酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3? 培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，固體加入瓊脂18～20 g/L。

完全培養(yǎng)基（CM）：酸水解酪蛋白1 g/L，蔗糖10 g/L，酵母提取物6 g/L，固體加入瓊脂18～20 g/L。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，固體加入瓊脂15～18 g/L，pH調(diào)節(jié)至7.5。

酵母選擇營養(yǎng)二缺培養(yǎng)基（SD/-Trp-Leu）：酵母氮源6.7 g/L，Trp/-Leu Droupout 0.64 g/L，葡萄糖20 g/L，調(diào)節(jié)pH到5.8。

酵母選擇營養(yǎng)四缺培養(yǎng)基（SD/-Trp-Leu- His-Ade）：酵母氮源6.7 g/L，Trp/-Leu/-His/-Ade Droupout 0.64 g/L，葡萄糖20 g/L，調(diào)節(jié)pH到5.8。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPDA）：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸腺嘌呤0.03 g/L。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹炭疽菌C. siamense CsSSK1基因的克隆和分析? 橡膠樹炭疽菌HN08菌株的總RNA提取使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒[購自于天根生化科技北（北京）有限公司]，按照說明書進行提取。對提取產(chǎn)物進行純度和完整性的檢測，符合目標(biāo)要求的RNA按照cDNA Synthesis SuperMxi（全式金公司）操作說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SSK1序列（Gene ID： 850692），采用本地BLAST方法，從橡膠樹炭疽菌基因組中搜索獲得同源序列，根據(jù)序列設(shè)計引物對pGBKT7-SSK1-F（5-CCGGAATTCATGGGTGCC CACAAGCCACA-3）/pGBKT7-SSK1-R（5-CGC GGATCCCTACTTCGGTATTACGCTGCGGAAC-3）。以橡膠樹炭疽菌cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。并將PCR產(chǎn)物回收連接載體PMD-18T獲得重組質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)過PCR驗證正確后挑取陽性轉(zhuǎn)化子，送往深圳華大基因研究院測序，重復(fù)3次。

比較分析DNA和cDNA序列，了解外顯子和內(nèi)含子，并與GenBank中同源序列進行分析，利用NCBI網(wǎng)站上的BLASTx軟件完成。cDNA序列翻譯成氨基酸序列，利用在線的簡單模塊構(gòu)架搜索工具（simple modular architecture research tool， SMART; http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/ set_mode.cgi）對氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)功能域分析[18]。

1.2.2? pGBKT7-CsSSK1誘餌載體的構(gòu)建? 提取上文中測序成功的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，將酶切下來的CsSSK1片段使用T4 DNA連接酶[購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司]與已經(jīng)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切完成的pGBKT7載體在16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，并對驗證正確的陽性克隆進行酶切驗證。

1.2.3? 誘餌表達載體毒性及自激活驗證? 將重組的載體pGBKT7-CsSSK1和pGADT7轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)Y2HGold中，涂布于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp- Leu-His-Ade營養(yǎng)缺失培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.2.4? 酵母雙雜交文庫篩選與回復(fù)試驗驗證? 將提取的pGBKT7-CsSSK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)Y2HGold中，并挑選在SD-Trp平板中生長正常的酵母單克隆，進行PCR驗證。挑取轉(zhuǎn)有重組質(zhì)粒的Y2HGold酵母菌株單菌落接種于50 mL的SD-Trp液體培養(yǎng)基中，把5 mL轉(zhuǎn)有誘餌基因的Y2HGold酵母菌液和1 mL橡膠樹膠孢炭疽菌cDNA文庫（Y187）合并在一個2 L的錐形瓶中，并加入45 mL的2×YPDA，30 ℃ 40 r/min培養(yǎng)24 h。用50 mL離心管1000 g離心10 min，收集菌體后用10 mL的0.5×YPDA溶液（卡納終濃度50 ?g/mL）重懸菌體，涂布于SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上，3～5 d后挑選正常生長的酵母單克隆，轉(zhuǎn)板到SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上，重復(fù)3次。3次轉(zhuǎn)板后仍正常生長的酵母單克隆用于做PCR驗證。提取酵母質(zhì)粒驗證后將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，送華大公司測序。去除重復(fù)的單克隆后將正確的菌種保存于-80 ℃冰箱。提取測序正確的互作蛋白質(zhì)粒與誘餌載體pGBKT7-CsSSK1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGold中，涂布在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 橡膠樹炭疽菌CsSSK1基因的克隆及序列分析

以橡膠樹炭疽菌C. siamense HN08總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA和DNA為模板，分別擴增獲得目的條帶（圖1）。測序后得到橡膠樹炭疽菌CsSSK1基因序列，序列登錄號為ID：MN624171。測序分析結(jié)果顯示，擴增獲得的CsSSK1基因序列包含完整的開放閱讀框架數(shù)據(jù)，DNA序列大小為2750 bp，cDNA序列大小為2190 bp，該基因含有1個內(nèi)含子，編碼729個氨基酸，含有1個cheY同系物接收結(jié)構(gòu)域和10個復(fù)雜結(jié)構(gòu)，cheY結(jié)構(gòu)域包含1個被組氨酸激酶同源物磷酸化的磷酸受體位點（圖2）。

2.2? 誘餌載體pGBKT7-CsSSK1構(gòu)建及重組質(zhì)粒自激活檢測

將擴增得到的CsSSK1目的片段，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切得到目的片段，T4連接酶連接載體pGBKT7。用通用引物pGBKT7-F（5-TAATAC GACTCACTATAGGGC-3）/pGBKT7-R（5-AGATG GTGCACGATGCACAG-3）進行菌落PCR驗證，得到目的片段大小約為2190 bp。進行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切驗證（圖3），再經(jīng)測序驗證后保存陽性克隆待用。

將重組誘餌載體pGBKT7-CsSSK1與pGADT7空載體共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGlod，涂布于SD/-Trp-Leu缺陷培養(yǎng)基平板上長出酵母菌落（圖4A），說明pGBKT7-CsSSK1能夠在酵母菌株Y2HGold中成功表達，表達產(chǎn)物對宿主酵母菌沒有產(chǎn)生毒性。SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長（圖4B），說明pGBKT7- CsSSK1沒有自激活現(xiàn)象。

2.3? 酵母文庫的篩選和陽性克隆測序分析

以pGBKT7-CsSSK1為誘餌蛋白，從炭疽菌cDNA酵母文庫中篩選陽性克隆，在SD/-Trp-Leu- His-Ade缺陷培養(yǎng)基上重復(fù)篩選3次，得到27個陽性克隆。提取這些陽性克隆的DNA為模板，用引物對pGBKT7-F/R進行PCR驗證，結(jié)果顯示擴增出條帶的單克隆有23個，擴增獲得的片段大小在500～2000 bp之間（圖5）。

將23個陽性克隆的酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)進行擴增，進而提取質(zhì)粒送華大測序。對測序結(jié)果進行分析，排除重復(fù)序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blastx分析，結(jié)果顯示獲得10個候選互作蛋白，它們分別為：轉(zhuǎn)酮醇酶（transketolase）、金屬內(nèi)酰胺酶（β-lactamase）、鋅乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase）、泛素亞型X1（ubiquitin）、微管蛋白（tubulin）以及5個未知或假定蛋白（表1）。

2.4? 酵母雙雜交點對點回復(fù)驗證

將酵母雙雜交得到的10個陽性克隆提取質(zhì)粒，逐一與誘餌載體pGBKT7-CsSSK1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGlod后，結(jié)果顯示篩選到的10個陽性克隆都可以在SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培養(yǎng)基正常生長。說明10個陽性克隆在酵母體內(nèi)與CsSSK1產(chǎn)生互作（圖6）。

3? 討論

炭疽病是橡膠樹重要葉部病害之一，國內(nèi)外對橡膠樹炭疽菌致病性和抗藥性分子機理的研究基礎(chǔ)相對薄弱。SLN1-YPD1-SSK1級聯(lián)反應(yīng)是釀酒酵母中參與滲透協(xié)調(diào)的雙組分系統(tǒng)。在病原真菌中，該系統(tǒng)還參與耐藥性和毒力的調(diào)控[19]。組氨酸激酶（SLN1）感受外界壓力自磷酸化，然后將磷酸基團傳遞給磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（YPD1），再將磷酸基團傳遞給應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（SSK1）。現(xiàn)有的研究多在轉(zhuǎn)錄水平研究SSK1調(diào)控哪些基因？這些基因參與哪些功能？研究表明，SSK1在真核細胞中充當(dāng)接受和傳遞信號的功能，在高滲脅迫時，SSK1可迅速發(fā)生磷酸化，并激活下游HOG MAPK級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細胞內(nèi)甘油合成，促使細胞適應(yīng)滲透壓[19-20]。在這個過程中，已證實SLN1和SSK1都可與YPD1疏水區(qū)結(jié)合[20]。此外，在釀酒酵母中，用DNA微列陣方法，鑒定出SSK1還可以調(diào)控細胞壁合成相關(guān)基因，如AHP1、HSP12、PYC2等，進而調(diào)控細胞對氧化脅迫的調(diào)節(jié)[10]。但除了YPD1外，目前未見關(guān)于SSK1與其他蛋白直接互作的報道。本研究克隆了以炭疽菌CsSSK1基因，并以該基因編碼蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)對橡膠樹炭疽菌cDNA文庫進行篩選，結(jié)果顯示獲得的互作蛋白有轉(zhuǎn)酮醇酶、金屬β-內(nèi)酰胺酶、乙醇脫氫酶、微管蛋白及泛素亞型X1等。該結(jié)果表明SSK1作為雙組分系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，不僅可以與YPD1互作，通過轉(zhuǎn)移磷酸基團調(diào)控HOG MAPK途徑，可能還與其他蛋白相互作用存在其他功能，該研究結(jié)果為進一步研究CsSSK1的功能奠定基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)酮醇酶（transketolase）在戊糖磷酸酸循環(huán)以及光合成的還原型戊糖磷酸循環(huán)中起著重要作用[21]。有研究報道轉(zhuǎn)酮醇酶在稻瘟病的侵染中起到至關(guān)重要的作用，缺乏轉(zhuǎn)酮醇酶的病原菌可以順利產(chǎn)生附著胞并成功侵染，病原菌可以在細胞間存活，但是其有絲分裂過程變慢，影響病原菌在寄主細胞內(nèi)維持營養(yǎng)生長以及在細胞間的移動，加入外源ATP后此過程恢復(fù)正常[22]。本研究初步顯示CsSSK1可與轉(zhuǎn)酮醇酶發(fā)生體外互作，CsSSK1是否通過與轉(zhuǎn)酮醇酶互作，影響病原菌的侵染和生長，值得深入研究。

金屬β-內(nèi)酰胺酶是一種水解酶，在細菌中研究較多，與細菌耐藥機制有關(guān)，可以催化水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的特征性四元環(huán)，進而使β-內(nèi)酰胺類結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)生無效產(chǎn)物，最終導(dǎo)致該類抗生素失去抗菌活性[23]。已有研究證明SSK1對病原真菌的抗藥性有一定影響[13]，本研究初步顯示CsSSK1與金屬β-內(nèi)酰胺酶互作。病原真菌炭疽菌是否也通過SSK1調(diào)控金屬β-內(nèi)酰胺酶活性，從而調(diào)控菌體的抗藥性，需要進一步進行驗證。

除此之外，乙醇脫氫酶、微管蛋白、泛素亞型X1為篩選獲得的假定蛋白，它們與SSK1是否確實存在互作關(guān)系？互作的生物學(xué)意義又是什么？都有待進一步驗證。本研究僅僅是通過酵母雙雜交方法獲得的互作蛋白，由于酵母是簡單的真核生物，其蛋白質(zhì)加工、修飾類型及程度與炭疽菌可能存在差異，因此酵母雙雜的結(jié)果只是提示互相作用的可能性，后續(xù)還需要通過Co-IP、BiFC等技術(shù)對它們的互作性進行驗證。該研究結(jié)果可為進一步開展SSK1互作蛋白及豐富其功能研究奠定基礎(chǔ)。

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