石斛屬部分植物SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

張迎輝 杜溶訖 凡莉莉 楊旺利 榮俊冬 鄭郁善 陳禮光

摘? 要：建立石斛屬（Dendrobium）植物SRAP-PCR反應(yīng)體系，為石斛的品種鑒定與分類提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。采用單因素及正交試驗(yàn)對反應(yīng)體系中的各因子進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)退火溫度，并篩選有效引物。結(jié)果表明：適用于石斛屬植物SRAP最佳的反應(yīng)體系為：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，10×PCR buffer 2.5 μL，其余用滅菌后的ddH2O補(bǔ)足至25 μL。最優(yōu)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，36 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環(huán);94 ℃變性1 min，根據(jù)不同引物的不同退火溫度復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán);最終72 ℃延伸7 min，保存于4 ℃恒溫箱中。應(yīng)用所建立的優(yōu)化反應(yīng)體系成功地篩選出15條多態(tài)性較高的引物。

關(guān)鍵詞：石斛屬;SRAP;反應(yīng)體系;優(yōu)化

中圖分類號：Q75? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： The purpose of this study was to establish an optimized SRAP system for some species of Dendrobium.Single factor and orthogonal test designs were applied to optimize five factors， Mg2+， dNTPs， Taq DNA polymerase， primer and template DNA concentration， in the SRAP amplification system.Due to different species， the concentrations of Mg2+， dNTPs， Taq DNA polymerase， primers and template DNA in the SRAP reaction system were different， and the annealing temperature and the number of cycles in the amplification program also affected the experimental results， and finally the selection and establishment of Dendrobium SRAP optimal reaction system and amplification procedure was： Mg2+ 2.5 mmol/L， dNTPs 0.25 mmol/L， Taq DNA polymerase 1.25 U， primer 0.4 μmol/L， template DNA 30 ng， and the rest were filled with ddH2O. A total of 25 μL of amplification system was formed. The optimal amplification procedure was： pre-denaturation for 5 min at 94 ℃， denaturation for 1 min at 94 ℃， renaturation for 1 min at 36 ℃， extension for 1 min at 72 ℃， 5 cycles， denaturation at 94 ℃ for 1 min， depending on the annealing temperature of the different primers refolding for 1 min， extending at 72 ℃ for 1 min， 30 cycles， and finally extending at 72 ℃ for 7 min， stored at 4 ℃ constant temperature. A total of 15 primers with high polymorphism were successfully screened out by the optimized reaction system.

Keywords： Dendrobium; SRAP; reaction system; optimization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.004

石斛屬（Dendrobium）為蘭科（Orchidaceae）植物最大的一個屬，包含約1500～1600個種，其中我國分布有76種。雖然我國石斛屬資源在世界上的占有率比較低，但對于藥用方面的開發(fā)與利用一直走在前沿。藥用石斛的基原植物主要包含鐵皮石斛（D. officinale）、金釵石斛（D. nobile）、馬鞭石斛（D. fimhriatum）及其近似種[1]。石斛作為我國傳統(tǒng)類滋補(bǔ)的中藥，在生津益胃和清熱滋陰等方面具有功效顯著的特點(diǎn)，被視為保健祛病的優(yōu)品[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明石斛中主要含有多糖、聯(lián)芐類、菲類等多種化學(xué)成分，其在抗腫瘤、抗氧化等方面功效良好，具有較高的藥用價(jià)值[3]。隨著價(jià)格的不斷上升，市場出現(xiàn)種質(zhì)混雜、真?zhèn)舞b定困難等問題[4]。在石斛種質(zhì)鑒定方面，傳統(tǒng)的性狀分析需要有長期的經(jīng)驗(yàn)才能判斷[5]，顯微分析前期處理過程比較復(fù)雜，應(yīng)用范圍較窄，只能對顯微結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別的品種進(jìn)行鑒定[6-8]，理化分析研究范圍局限于不同化學(xué)成分、性狀相似而且沒有明顯顯微特征的石斛[9-10]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、指紋圖譜庫等領(lǐng)域[11-14]。分子標(biāo)記技術(shù)可檢測植物不同生長發(fā)育時期的任何組織器官，具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、數(shù)量大等優(yōu)勢[15]。目前，DNA分子標(biāo)記在石斛屬分類鑒定方面得到廣泛應(yīng)用，段媛媛等[16]對鐵皮石斛和霍山石斛（D. huoshanense）進(jìn)行ISSR鑒定體系的建立與優(yōu)化，可用于2種石斛的鑒別;趙庭梅等[17]研究表明基因組SSR標(biāo)記在鐵皮、迭鞘（D. denneanum）和金釵石斛種間具有較好的轉(zhuǎn)移性，在種內(nèi)具有良好的多態(tài)性，為石斛的遺傳研究和分子輔助育種提供依據(jù)。SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism）標(biāo)記法是一種新型的分子標(biāo)記方法，具備多態(tài)性高、引物使用效率較高、簡單快捷、分布均勻等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)建立了適用于石斛屬植物SRAP-PCR反應(yīng)體系，并篩選出有效的引物，為石斛的品種鑒定與分類提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 供試的32種石斛樣品采自于福建省福安旺盛經(jīng)濟(jì)林研究所石斛種質(zhì)資源圃（表1）。每種石斛取樣7～10株，每株取3～5片新鮮嫩葉，裝入塑料自封袋中，用變色硅膠（硅膠與葉片體積比例至少為10∶1）迅速干燥放入冰盒中，快速將干燥的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，并于?80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 儀器? 主要儀器包括Mastercycler pro梯度基因擴(kuò)增儀、DYY-8C電泳儀、JS-680D凝膠成像分析儀、NanoDrop2000C紫外分光光度計(jì)等。

1.1.3? 試劑? 10×PCR buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）試劑購于大連TaKaRa公司;DNA梯形標(biāo)記（100 bp）、6×loading Buffer購自生工生物工程（上海）股份有限公司;低電滲瓊脂糖（Agarose）、核酸染料（GoodViewTM）購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;羥基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）、三氯甲烷、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純。SRAP引物選取8條上游引物和7條下游引物，均由尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? SRAP-PCR原初反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的建立? 參考顏平[18]和司更花[19]研究的蘭科植物SRAP反應(yīng)體系，石斛的SRAP初始擴(kuò)增反應(yīng)體系如下設(shè)定：25 μL的擴(kuò)增體系中含有2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L MgCl2，300 μmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶1 U，上下游引物各0.4 μmol/L，模板DNA為30 ng。初始反應(yīng)程序設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，36 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環(huán);94 ℃變性1 min，51 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán);最終72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.2? 初始引物的篩選? 選擇一個DNA模版對56對引物進(jìn)行初篩，從中挑選條帶清晰、重復(fù)良好、穩(wěn)定性較好的多態(tài)性引物，最終選擇的上游引物為Me1，下游引物為Em3。引物的堿基序列見表2。

1.2.3? 石斛SRAP-PCR反應(yīng)體系的單因素試驗(yàn)? 設(shè)計(jì)? 不同濃度Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA進(jìn)行依次試驗(yàn)（表3），研究各因子對SRAP反應(yīng)的影響。引物選擇上游引物為Me1，下游引物為Em3。

1.2.4? 石斛SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 對Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA等5個因素開展正交試驗(yàn)（表4）。反應(yīng)體系為25 μL，引物選擇上游引物為Me1，下游引物為Em3，含有2.5 μL 10×buffer，其余用滅菌后的ddH2O補(bǔ)足。

1.2.5? 擴(kuò)增反應(yīng)程序退火溫度及循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化? 利用單因素試驗(yàn)篩選出石斛SRAP-PCR反應(yīng)體系的最優(yōu)退火溫度和循環(huán)次數(shù)，其中循環(huán)次數(shù)設(shè)定6個水平，分別為28、30、32、35、38、40次。退火溫度設(shè)定12個水平，分別為39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4、51.1、53.8、56.2、58.1、59.5、60.1 ℃。

1.2.6? SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測? 取8.5 μL依據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序得來的PCR產(chǎn)物與1.5 μL 6×loading Buffer充分混勻，加到含有核酸染料（GoodViewTM）的1.2%的瓊脂糖凝膠中，電泳45 min，電壓設(shè)為120 V，電流設(shè)為120 A，電泳結(jié)束后將凝膠放入紫外凝膠成象分析儀中檢測拍照。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Mg2+濃度的篩選

不合理的Mg2+濃度會大大降低引物和DNA的結(jié)合效率，影響DNA和PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而產(chǎn)生引物二聚體降低產(chǎn)物的特異性[20]。設(shè)定8個Mg2+濃度梯度，如圖1所示，當(dāng)Mg2+濃度小于或等于1.0 mmol/L時，無條帶出現(xiàn)，當(dāng)Mg2+濃度為2.5～4.0 mmol/L時，擴(kuò)增條帶數(shù)一致，從降低試驗(yàn)成本考慮，反應(yīng)液中Mg2+最佳濃度確定為2.5 mmol/L。

2.2? DNA濃度的篩選

通常DNA濃度的高低會直接影響擴(kuò)增試驗(yàn)的效果，出現(xiàn)無擴(kuò)增產(chǎn)物或者擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定的現(xiàn)象[21]。但本研究發(fā)現(xiàn)不同的DNA濃度均能擴(kuò)增出清晰明亮的條帶（圖2），為節(jié)省成本，選定模板DNA的最適濃度為10 ng。

2.3? dNTPs濃度的篩選

dNTPs作為PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)，參與新鏈DNA的合成，對PCR反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生顯著的影響，選擇最佳dNTPs濃度對PCR反應(yīng)至關(guān)重要[22]。如圖3所示，當(dāng)dNTPs濃度為0.05～0.15 mmol/L時，擴(kuò)增的條帶數(shù)量較少且模糊不穩(wěn)定;當(dāng)dNTPs濃度為0.35～0.40 mmol/L時，擴(kuò)增條帶數(shù)量少，所以綜合考慮選定dNTPs的最佳濃度為0.20 mmol/L，此時條帶數(shù)量多、穩(wěn)定且清晰。

2.4? Taq DNA聚合酶濃度的篩選

Taq DNA聚合酶濃度過高易出現(xiàn)非特異性條帶，并增加試驗(yàn)成本，其濃度過低會影響新鏈合成效率，甚至無擴(kuò)增[23]。當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度為0.25～0.75 U和1.50～2.00 U時，擴(kuò)增的條帶數(shù)量少且模糊，當(dāng)濃度為1.00 U時，擴(kuò)增的條帶數(shù)量多且清晰（圖4），所以選定Taq DNA聚合酶的最佳濃度為1.00 U。

2.5? 引物濃度的篩選

在SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)中引物的作用是與DNA模板特異性結(jié)合，引導(dǎo)新鏈的合成，其濃度主要影響擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，濃度過高會產(chǎn)生錯配與非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，提高引物二聚體的形成，濃度過低則無法進(jìn)行有效擴(kuò)增[24]。當(dāng)引物濃度為0.1～0.2 μmol/L時，條帶較少且模糊;當(dāng)濃度為0.3～0.8 μmol/L時，條帶穩(wěn)定且清晰（圖5），綜合成本考慮，選定最佳引物濃度為0.3 μmol/L。

2.6? 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的直觀分析

對石斛SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，處理7、處理8、處理12擴(kuò)增的條帶多且清晰，處理1、2和處理13、14擴(kuò)增的條帶較少且模糊，擴(kuò)增的效果較差（圖6）。參照田艷伶等[25]的方法，依據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后條帶的數(shù)量多少和條帶的明暗度、清晰度來進(jìn)行評分，最佳產(chǎn)物記16分，最差的計(jì)1分。2次重復(fù)分別獨(dú)立統(tǒng)計(jì)，16種處理的分?jǐn)?shù)評定分別為：3、14、13、12、1、11、15、16、2、6、7、10、4、5、8、9;5、6、12、10、9、11、13、16、1、7、8、15、2、3、4、14。

依據(jù)平均分值進(jìn)行直觀分析與方差分析（表5），極差R反應(yīng)出各試驗(yàn)因子對SRAP反應(yīng)體系的影響，R值越大，則影響越顯著[25]，因此，各試驗(yàn)因子對SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響依次為：dNTPs>Mg2+>Taq DNA聚合酶>引物>模板DNA;而ki則反應(yīng)各試驗(yàn)因子不同水平對反應(yīng)體系的影響大小，ki越大則對反應(yīng)體系越有效。因此，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)極差分析中，SRAP-PCR標(biāo)記的反應(yīng)體系的最優(yōu)條件為：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 60 ng，共25 μL體系。

2.7? 循環(huán)次數(shù)和退火溫度對SRAP擴(kuò)增的影響

對循環(huán)次數(shù)設(shè)定6個梯度，分別為28、30、32、35、38、40次，如圖7所示，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為38次時，擴(kuò)增的條帶數(shù)量最多且清晰。

利用建立的最佳擴(kuò)增體系，選擇上游引物為Me1，下游引物為Em3，對其退火溫度進(jìn)行梯度篩選，當(dāng)退火溫度在40～60 ℃時，自動設(shè)定的梯度溫度分別為39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4、51.1、53.8、56.2、58.1、59.5、60.1 ℃。當(dāng)退火溫度為39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4 ℃時，擴(kuò)增的條帶較模糊且數(shù)量少，當(dāng)退火溫度為51.1、53.8、56.2、58.1 ℃時擴(kuò)增條帶雖然清晰但數(shù)量少，當(dāng)退火溫度為59.5 ℃時，其擴(kuò)增的條帶數(shù)量多且清晰（圖8），因此，選定59.5 ℃作為上游引物為Me1，下游引物為Em3的最佳退火溫度。按此方法進(jìn)一步確定了15對有效引物的最優(yōu)退火溫度（表6）。

2.8? SRAP有效引物篩選及反應(yīng)體系的檢測

運(yùn)用正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合，最終確定石斛SRAP-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，2.5 μL 10×buffer，剩余用ddH2O補(bǔ)齊，共25 μL體系。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，36 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環(huán);94 ℃變性1 min，根據(jù)引物退火溫度復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán);72 ℃延伸7 min，最后設(shè)定4 ℃保存。依據(jù)石斛優(yōu)化后的最優(yōu)反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，對56對引物進(jìn)行擴(kuò)增，最終篩選出15對有效引物（表6）。以31種石斛屬植物和金石斛的DNA為模板，用篩選出的有效引物在已優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序下進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶清晰度高（圖9），符合試驗(yàn)要求。

3? 討論

SRAP分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、引物使用效率高、簡單穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[17]，但也受到反應(yīng)體系中Mg2+濃度等多種因素的影響[12]，這是因?yàn)镸g2+濃度變化可能會減弱Taq DNA聚合酶活性，降低引物和DNA的結(jié)合效率，此外，Mg2+濃度變化也會影響DNA和PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而產(chǎn)生引物二聚體降低產(chǎn)物的特異性[20]。正交試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Mg2+濃度是影響石斛屬植物SRAP-PCR反應(yīng)體系的重要因子之一。DNA做為擴(kuò)增反應(yīng)的基礎(chǔ)，其濃度過大或過小時，PCR擴(kuò)增會產(chǎn)生許多不需要的非特異性產(chǎn)物或不能擴(kuò)增到任何產(chǎn)物[21]，但本試驗(yàn)中不同的DNA濃度均能擴(kuò)增出清晰明亮的條帶。dNTPs濃度對擴(kuò)增產(chǎn)物的量有較大的影響，濃度過低會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定或擴(kuò)增出來的條帶模糊不清，濃度過高會提高堿基錯配率和試驗(yàn)成本[22]，試驗(yàn)結(jié)果表明dNTPs濃度對石斛屬植物SRAP-PCR反應(yīng)體系的影響最顯著。Taq DNA聚合酶濃度對SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)生顯著的影響，其濃度過高易出現(xiàn)非特異性條帶，并增加試驗(yàn)成本，其濃度過低會影響新鏈合成效率，甚至無擴(kuò)增[23]。在SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)中引物的濃度直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，濃度過高易出現(xiàn)非特異性條帶，并形成引物二聚體，濃度過低則擴(kuò)增產(chǎn)物量無法滿足要求[24]。循環(huán)次數(shù)、退火溫度對石斛SRAP- PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一定的影響，循環(huán)次數(shù)減少，擴(kuò)增的條帶相對減少且清晰度降低，反之循環(huán)次數(shù)越多，則會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。另外，退火溫度太高也會影響引物和模板DNA的結(jié)合率降低，從而減少條帶數(shù)。

本研究最終確定的石斛屬植物SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系為：擴(kuò)增體系為25 μL，其中Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，剩余用滅菌的ddH2O補(bǔ)足。最優(yōu)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min;36 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環(huán);94 ℃變性1 min，根據(jù)引物退火溫度復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán);最終72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。以上述最佳反應(yīng)體系與最優(yōu)擴(kuò)增程序?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行引物篩選，在56對引物中篩選出15對重復(fù)性較好、多態(tài)性較高、擴(kuò)增條帶較為清晰的引物。