金蕎麥聯(lián)合SASP治療大腸濕熱型UC的療效及其對TLR4/NLRP3信號通路的影響

葛飛,劉麗娜,嚴晶,康安,朱時林,田祖成,梅莉,代海峰,倪海軍

(1.南京中醫(yī)藥大學翰林學院海安附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226600；2.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是消化系統(tǒng)常見病，近年在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢。究其病因，可能與遺傳、環(huán)境因素、飲食習慣和人體免疫等多因素有關(guān)，具體機制尚不明確[1]。近年來的研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)[2]、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)信號、炎癥小體信號通路中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor3，NLRP3)和效應蛋白半胱天冬酶1(Caspase-1)等的異常激活相關(guān)，導致一系列炎癥因子的釋放[3]。

UC治療困難、易反復，目前臨床上多使用5-氨基水楊酸類藥物、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等進行癥狀的控制，臨床實踐上仍缺乏特效藥。近年來，中醫(yī)藥在UC治療中的應用越來越普遍，許多中醫(yī)經(jīng)典方劑及中藥在UC治療中，發(fā)揮著獨特的療效。研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療UC療效顯著優(yōu)于單一的中醫(yī)或西醫(yī)治療，能顯著改善患者的生活質(zhì)量，具有較好的發(fā)展前景[4]。

UC屬于中醫(yī)學“腹痛”“泄瀉”“便血”等范疇相關(guān)，大腸濕熱證為最常見證型[5]。金蕎麥具有清熱解毒利濕之功，作為江蘇南通的道地中藥材，被廣泛用于治療肺炎、細菌性痢疾等。課題組前期研究表明，金蕎麥治療腹瀉型腸易激綜合征[6]及UC[7]均有一定療效，其機制可能與調(diào)控炎癥通路有關(guān)，但臨床研究報道少見。本研究旨在課題組前期研究基礎(chǔ)上，進一步觀察金蕎麥聯(lián)合傳統(tǒng)西藥柳氮磺吡啶(Sulfasalazine，SASP)對UC的臨床療效及治療前后患者結(jié)腸活檢組織中相關(guān)炎癥信號通路的影響，探討金蕎麥協(xié)同西藥SASP對UC治療的可能機制。

1 臨床資料

1.1 一般資料

按照中華醫(yī)學會《臨床診療指南·消化系統(tǒng)疾病分冊》[8]的診斷標準選取2015年2月-2016年2月在海安市中醫(yī)院門診治療的72例UC患者，舌脈表現(xiàn)為舌質(zhì)紅苔黃膩，脈滑數(shù)。采用隨機數(shù)字表法將72例患者隨機分為2組，各36例。對照組男性20例，女性16例;平均年齡(38.90±8.85)歲；平均病程(1.50±1.45)a;輕度22例，中度14例。治療組男性19例，女性17例；平均年齡(40.18±9.02)歲;平均病程(1.72±1.33)a;輕度23例，中度13例[8]。2組患者的性別、年齡、病程、疾病類型及病情嚴重程度等資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。該項目研究開展前經(jīng)海安市中醫(yī)院倫理委員會審查同意(海中醫(yī)倫理〔2015〕001號)。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 參照中華醫(yī)學會《臨床診療指南·消化系統(tǒng)疾病分冊》[8]。①臨床表現(xiàn)：有反復或持續(xù)發(fā)作的腹瀉、腹痛及黏液膿血便，多數(shù)伴里急后重，部分可伴腸外表現(xiàn)，有不同程度的全身癥狀。②結(jié)腸鏡檢查：可見病變呈連續(xù)性、彌漫性分布，黏膜質(zhì)脆、水腫、充血，可見出血和膿性分泌物附著等，重者可見糜爛或潰瘍。鏡下結(jié)腸袋變淺或消失，慢性UC可見到假息肉和橋狀黏膜。鋇灌腸亦有鉛管征等特征性表現(xiàn)。③黏膜活檢或手術(shù)標本：可見炎癥細胞浸潤以單核細胞為主，伴糜爛，嚴重者可有潰瘍,隱窩周圍炎和隱窩膿腫：腺體紊亂、萎縮，杯狀細胞減少,可見潘氏細胞化生。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 根據(jù)中國中西醫(yī)結(jié)合學會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會2017年發(fā)布的《潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見》[9]，其中大腸濕熱證的主癥表現(xiàn)為腹瀉,腹痛,黏液膿血便，里急后重；次癥為肛門灼熱，身熱不揚，口苦口干，小便短赤。舌質(zhì)紅苔黃膩，脈滑數(shù)。

診斷需主癥2項和次癥1項或2項，理化檢查和舌脈象等作為參考。

1.3 納入標準

符合上述西醫(yī)UC診斷標準，中醫(yī)辨證為大腸濕熱證；慢性復發(fā)型或初發(fā)型；簽訂知情同意書；受試前4周內(nèi)沒有服用除本研究方案之外的其他藥物。

1.4 剔除標準

伴有直腸癌、中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔、腸梗阻、心腦血管疾病、肝腎功能不全及智障患者不能配合治療方案者。

1.5 脫落標準

不能按要求完成臨床實驗，撤回知情同意書或不能按方案隨訪復查者。

2 方法

2.1 治療方法

對照組：予柳氮磺吡啶腸溶片(SASP，上海福達制藥有限公司，0.25 g×60片)，每次1 g，4次/d，餐后服，連服1個月。療程中患者三餐前同時服用安慰劑藥片，顏色大小同金蕎麥片，每次5片。患者治療期間避免使用糖皮質(zhì)激素及其他類似5-氨基水楊酸制劑等藥物，避免干擾實驗結(jié)果。

治療組：在與對照組同樣服法和療程應用SASP基礎(chǔ)上，餐前加用金蕎麥片(南通精華制藥廠，90片/盒)，每次5片，每天3次，連服1個月。注意事項同治療組。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 中醫(yī)證候評分 參照《2002年中藥新藥臨床研究指導原則》[10]進行中醫(yī)證候評分，將腹瀉、腹痛、便血、腹脹、里急后重等癥狀按輕重程度分別記為0、1、2、3分，積分越高，癥狀越重。

2.2.2 改良Mayo評分及臨床療效評價 根據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》(2018，北京)[11]，改良Mayo評分評估項目包括便血、排便次數(shù)、內(nèi)鏡表現(xiàn)、醫(yī)師總體評估等。臨床緩解：無單個評分>1分且評分≤2分；輕度活動：3～5分；中度活動：6～10分；重度活動：11～12分。內(nèi)鏡下黏膜愈合：Mayo評分內(nèi)鏡亞評分的絕對值為0分或1分；內(nèi)鏡應答：Mayo評分相對于基線至少下降1分(內(nèi)鏡亞評分)。

2.2.3 血清中白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平測定 治療前后分別取患者外周靜脈血5 mL，4 ℃下靜置30 min，以3 000 r/min離心15 min后取上清液，分裝保存于-80 ℃冰箱待用。采用ELISA法檢測。人IL-1β(貨號：437004)，TNF-α(貨號：430204)試劑盒購自美國Biolegend公司，按說明書進行操作。

2.2.4 活檢結(jié)腸黏膜免疫組化 應用石蠟包埋的活檢結(jié)腸黏膜切片進行TLR4、NLRP3、Caspase-1和IL-1β(抗體均購自武漢谷歌生物科技有限公司)免疫組化分析。切片被脫蠟后，應用二甲苯和乙醇梯度溶液進行再水化，然后用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)清洗。將組織切片應用稀釋度為(1∶50)的上述一抗抗體孵育2 h，PBS洗滌3次后在室溫下與生物素化的二抗共同孵育，時間30 min。洗滌后，再將組織切片孵育在辣根過氧化物酶(HRP)生物素復合物底物中,時間30 min。切片根據(jù)標準方案通過3,30-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，應用標準方法放置到奧林巴斯顯微鏡下拍片、觀察。

2.3 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

對照組脫落2例。

3.1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分情況比較

結(jié)果見表1。

表1 2組治療前后中醫(yī)證候積分情況比較

3.2 2組患者治療前后改良Mayo評分情況比較

結(jié)果見表2。

3.3 2組患者黏膜愈合情況比較

結(jié)果見表3。

3.4 2組患者結(jié)腸病理HE染色

我們在治療組和對照組中分別選擇了2～3例患者，在治療前和治療后的腸鏡檢查中，采集了結(jié)腸活檢組織，進行了HE染色及閱片，結(jié)果如圖1所示，在治療組中，患者經(jīng)金蕎麥片與SASP片聯(lián)合治療后，其結(jié)腸病變情況顯著好轉(zhuǎn)。

表2 2組治療前后改良Mayo評分情況比較

表3 2組黏膜愈合情況比較

圖1 2組結(jié)腸病理變化(HE,×100)

3.5 2組患者治療前后血清IL-1β、TNF-α水平比較

結(jié)果見表4。

表4 2組治療前后血清IL-1β、TNF-α水平 比較

3.6 2組患者治療前后NLRP3相關(guān)蛋白及TLR4蛋白變化

我們采用免疫組化法對收集到的結(jié)腸活檢樣品進行免疫組化分析，由于每組納入的病例數(shù)較少，無法進行定量描述。如圖2所示，我們通過閱片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在治療組中，經(jīng)金蕎麥片與SASP片聯(lián)合治療后，TLR4、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表達量有所下降。且治療組治療后，NLRP3和IL-1β的表達與對照組治療后相比，下降更為顯著。

圖2 患者腸黏膜組織中TLR4、NLRP3、Caspase-1和 IL-1β的免疫組化圖

3.7 2組不良反應比較

經(jīng)臨床觀察，2組發(fā)生的不良反應主要由藥物引起，經(jīng)及時對癥處理，均未影響治療及實驗進程。其中對照組共發(fā)生5例，1例頭痛，2例惡心，2例白細胞減少，發(fā)生率為14.70%。治療組發(fā)生6例，2例頭痛，3例惡心，1例白細胞減少，發(fā)生率為16.67%。治療組不良反應率與對照組無差異(P>0.05)。

4 討論

UC在西方國家十分常見，在發(fā)展中國家發(fā)病率相對較低，但近年我國關(guān)于UC報道的病例顯著增加，可能與飲食及環(huán)境等因素變化有關(guān)。UC患者表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及黏液膿血便三大典型癥狀，部分患者有原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)或皮膚紅斑等結(jié)腸外表現(xiàn)。多數(shù)UC患者病程遷延難愈，急性起病較少，長期反復發(fā)作有致癌的風險。

隨著醫(yī)學領(lǐng)域的快速發(fā)展，近年UC治療方法較多，但至今尚未有突破性治療手段。傳統(tǒng)的氨基水楊酸、激素等四類藥物仍是目前UC治療的主要藥物[12]，療效并不理想，且有較大的副作用，導致病人依從性不高。近年研發(fā)的生物制劑等新藥因費用高昂等原因尚未能常規(guī)推廣[13]。為此，尋求有效、安全的傳統(tǒng)中藥制劑或中西醫(yī)聯(lián)合療法成為中醫(yī)消化界研究的熱點。從病機而言，UC主要與脾胃受損、運化失健相關(guān)，進而日久化熱，導致腸道濕濁內(nèi)生而蘊結(jié)，氣機受阻最終致腸腑失司。從臟腑角度，肺與大腸相表里，病在腸者，亦可調(diào)肺以治之[14]。

金蕎麥傳統(tǒng)用于肺膿瘍等治療，其功效為清熱、利濕、解毒。作者及其課題組一直致力于南通道地藥材金蕎麥的功效研究，根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，課題組發(fā)現(xiàn)金蕎麥提取物有抗炎、調(diào)節(jié)腸道免疫之功效，動物實驗表明與其抑制NF-κB/NLRP3炎癥通路相關(guān)[15]，金蕎麥有望研制成為治療UC的新藥。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)金蕎麥聯(lián)合SASP治療UC效果更佳，主要表現(xiàn)在抑制促炎性細胞因子如IL-1β和TNF-α的分泌。由于促炎性細胞因子的分泌與體內(nèi)TLR4和NLRP3信號通路的激活有關(guān)，我們對收集的患者結(jié)腸活檢樣品中，分析了相關(guān)蛋白的免疫組化結(jié)果，結(jié)果表明金蕎麥片聯(lián)合SASP治療對NLRP3和IL-1β的下調(diào)作用更為明顯，這可能是金蕎麥聯(lián)合SASP治療UC效果優(yōu)于單獨應用SASP的原因。

綜上所述，金蕎麥聯(lián)合SASP治療UC明顯優(yōu)于單用西藥SASP，為中西醫(yī)結(jié)合治療UC提供了新途徑，其作用機制可能與UC患者體內(nèi)TLR4/NLRP3炎癥信號通路受到抑制有關(guān)。結(jié)合前期動物實驗及臨床實踐表明，傳統(tǒng)中藥金蕎麥抗炎作用確切，該藥經(jīng)過研發(fā)有可能成為UC治療的有效新藥。本實驗的不足之處是病理機制研究納入樣本量偏小，觀察持續(xù)時間偏短等，今后將繼續(xù)開展多中心、大樣本、長期跟蹤研究。