基于葉片顯微結(jié)構(gòu)綜合評(píng)價(jià)馬鈴薯不同品種的抗旱性

馬 勝，齊恩芳，文國(guó)宏，李 掌，曲亞英，鄭永偉，白永杰，賈小霞*

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.國(guó)家種質(zhì)資源渭源觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 渭源 748201）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）用途廣泛，不僅關(guān)系到糧食安全，而且是解決貧困的支柱產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)，隨著國(guó)家馬鈴薯“主糧化”戰(zhàn)略的推進(jìn)，其在中國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的地位更加突出。西北半干旱區(qū)是中國(guó)馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，但干旱往往導(dǎo)致產(chǎn)量低而不穩(wěn)。因此，研究馬鈴薯的抗旱性并進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)具有重要的科學(xué)和實(shí)踐意義。植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，由于受光照、氣溫、水分等自然環(huán)境因子的影響，根、莖、葉、花、果、實(shí)等形成了一套獨(dú)特的外部形態(tài)特征[1]。作為與環(huán)境直接接觸的主要器官，葉片是光合作用和呼吸作用的主要場(chǎng)所，其結(jié)構(gòu)特征最易受到環(huán)境條件的影響，在不同的選擇壓力下形成了適應(yīng)各種逆境的差異類(lèi)型，其形態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)特征也充分顯示了對(duì)不同生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性[2]。目前，有關(guān)葉片形態(tài)特征與抗旱性的關(guān)系已受到很多學(xué)者關(guān)注[3,4]，研究表明，葉片厚度、中脈厚度、柵欄組織厚度、氣孔密度[5,6]、葉片上下表皮厚度、海綿組織厚度、柵海比、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度、海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度[7,8]等葉片解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)可作為植物抗旱性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。目前對(duì)于馬鈴薯抗旱性的比較多集中在水分生理指標(biāo)、滲透調(diào)節(jié)指標(biāo)、光合作用指標(biāo)、活性氧清除系統(tǒng)及膜脂過(guò)氧化指標(biāo)、內(nèi)源激素指標(biāo)、產(chǎn)量指標(biāo)[9,10]等方面。秦天元等[11]和盧福順[12]分別研究了干旱脅迫對(duì)馬鈴薯根尖和葉片超微結(jié)構(gòu)的影響，但基于葉片解剖結(jié)構(gòu)對(duì)馬鈴薯不同品種進(jìn)行抗旱性分析的研究還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究選取甘肅省主栽的4個(gè)馬鈴薯品種，對(duì)其葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)測(cè)分析，并通過(guò)隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)其抗旱性，旨在提供一些關(guān)于馬鈴薯抗旱栽培和抗旱育種方面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為馬鈴薯栽培種‘隴薯6 號(hào)’‘隴薯10號(hào)’‘隴薯14 號(hào)’和‘莊薯3號(hào)’原種（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所早熟育種研究室提供），試驗(yàn)在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所榆中試驗(yàn)站抗旱棚中開(kāi)展，抗旱棚土壤為黃棉土，土壤肥力中上等，播前施羊糞40 m3/hm2、硫酸鉀（K2O 50%）280 kg/hm2、磷酸二銨（P2O546%；N 18%）200 kg/hm2、尿素（N 46%）160 kg/hm2作基肥，澆透水后，于2020 年4月25 日土壤濕度適宜播種時(shí)露地平播，每品種3次重復(fù)，每重復(fù)2行，每行10株，行距60 cm，株距33 cm，播后不再澆水，直至盛花期采集葉片。榆中試驗(yàn)站位于N 35.85°，E 104.12°，海拔1 960 m，年均氣溫6.7℃，年均降水量350 mm，無(wú)霜期120 d左右，屬溫帶半干旱區(qū)。

1.2 葉片組織結(jié)構(gòu)觀(guān)察

葉片組織結(jié)構(gòu)采用石蠟切片法進(jìn)行觀(guān)察[13]。于2020年7月18日（盛花期）采集葉片，分別選取4個(gè)品種倒數(shù)第四個(gè)完全展開(kāi)葉片，每個(gè)樣品3 次重復(fù)，自來(lái)水沖洗干凈后，橫切葉片中部約2 cm×2 cm組織，先用FAA固定液固定，再用二甲苯和無(wú)水乙醇進(jìn)行處理后，制作石蠟切片，番紅固綠雙重對(duì)染后進(jìn)行封膠。使用PANNORAMIC 全景切片掃描儀將組織切片上所有的組織信息都掃描成像形成一個(gè)文件夾，使用CaseViewer2.2掃描瀏覽軟件選取組織的目的區(qū)域進(jìn)行200倍成像，成像完成后，葉片、上下表皮、葉片中脈、角質(zhì)層、柵欄組織和海綿組織等各指標(biāo)的厚度通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行測(cè)量分析，各指標(biāo)均為10次測(cè)量值的平均值，然后求出柵海比、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度（RT）和海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度（RL）。

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

RT（%）=柵欄組織厚度/葉片厚度×100

RL（%）=海綿組織厚度/葉片厚度×100

用Image-Pro Plus 6.0軟件分別測(cè)量每張切片中6個(gè)氣孔的寬度，并測(cè)量對(duì)應(yīng)的12個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞的縱軸長(zhǎng)與橫軸長(zhǎng)、整個(gè)組織的長(zhǎng)度；分別計(jì)數(shù)組織上氣孔數(shù)量與葉脈數(shù)量，計(jì)算出單位長(zhǎng)度上氣孔密度（n/mm）、單位長(zhǎng)度上葉脈數(shù)量。

氣孔密度（n/mm）=氣孔數(shù)量/整個(gè)組織的長(zhǎng)度

葉脈密度（n/mm）=葉脈數(shù)量/整個(gè)組織的長(zhǎng)度

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步處理，DPS V 3.01 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析；試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性用Duncan's分析，所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)不同品種進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)[14]，先求每個(gè)品種所有單一指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，再計(jì)算不同品種所有指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值，平均隸屬函數(shù)值的大小，分別代表抗旱性的強(qiáng)弱。與抗旱性呈正相關(guān)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值用公式X（μ1）=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）計(jì)算，與抗旱性呈負(fù)相關(guān)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值用公式X（μ2）=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）計(jì)算，式中X表示某一品種某一指標(biāo)的測(cè)定值，Xmin表示4個(gè)品種中某一指標(biāo)的最小值，Xmax表示4個(gè)品種中某一指標(biāo)的最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同馬鈴薯品種葉片解剖結(jié)構(gòu)共同特征

馬鈴薯葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)的基本組成相同（圖1），即葉片為異面葉，由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮組成，上表皮厚度和上表皮細(xì)胞都較大，下表皮厚度和下表皮細(xì)胞均較小且不規(guī)則。柵欄組織在上表皮下面，均由1層排列較緊密的長(zhǎng)柱型細(xì)胞構(gòu)成；在柵欄組織與下表皮之間的海綿組織，由排列疏松且形狀不規(guī)則的細(xì)胞組成。

圖1 不同馬鈴薯品種葉片橫切面Figure 1 Cross-sections of different potato variety leaves

2.2 不同馬鈴薯品種葉片顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比

不同品種馬鈴薯葉片的解剖特征參數(shù)量化上存在一定的差別（表1）?！f薯3 號(hào)’葉片厚度最大（178.32 μm），顯著高于其他3個(gè)品種；‘隴薯10號(hào)’葉片厚度（170.62 μm）位居第二，顯著高于‘隴薯6號(hào)’和‘隴薯14號(hào)’；‘隴薯14號(hào)’和‘隴薯6號(hào)’的葉片厚度較小，分別為157.64 和153.62 μm，二者有差異，但未達(dá)到顯著水平。‘莊薯3號(hào)’的上表皮厚度最大（24.28 μm），顯著高于其他3個(gè)品種；其余3個(gè)品種的上表皮厚度依次為‘隴薯6 號(hào)’（21.86 μm）、‘隴薯10號(hào)’（20.97 μm）和‘隴薯14號(hào)’（20.85 μm），他們之間互相都未達(dá)到顯著水平?！f薯3號(hào)’的下表皮厚度最大（15.24 μm），顯著高于其他3 個(gè)品種；其余3個(gè)品種的下表皮厚度依次為‘隴薯14號(hào)’（14.90 μm）、‘隴薯6號(hào)’（14.53 μm）和‘隴薯10號(hào)’（12.58 μm），‘隴薯14號(hào)’和‘隴薯6號(hào)’有差異，但差異不顯著，但都顯著高于‘隴薯10 號(hào)’。角質(zhì)層厚度依次為‘隴薯 6 號(hào)’（5.69 μm）、‘隴薯 10 號(hào)’（5.14 μm）、‘莊薯3 號(hào)’（5.09 μm）和‘隴薯14 號(hào)’（4.62 μm），其中‘隴薯14 號(hào)’顯著低于其他3 個(gè)品種。中脈厚度依次為‘隴薯14號(hào)’（1.21 mm）、‘隴薯6號(hào)’（1. 11 mm）、‘隴薯10號(hào)’（1.05 mm）和‘莊薯3號(hào)’（0.98 mm），其中‘莊薯3號(hào)’顯著低于其他2個(gè)品種?！f薯3號(hào)’的柵欄組織厚度（63.88 μm）和海綿組織厚度（74.55 μm）都最大，顯著厚于其他3個(gè)品種（‘隴薯10號(hào)’海綿組織厚度除外）；柵欄組織厚度和海綿組織厚度最小的品種分別為‘隴薯14 號(hào)’（55.06 μm）和‘隴薯6號(hào)’（67.77 μm），小于其他3個(gè)品種。各品種的柵海比、葉片RT和葉片RL雖然存在差異，但均未達(dá)到顯著水平。

表1 不同馬鈴薯品種葉片解剖結(jié)構(gòu)比較Table 1 Comparisons of anatomical structures of different potato variety leaves

2.3 不同馬鈴薯品種葉脈氣孔特征對(duì)比

4個(gè)馬鈴薯品種的葉脈氣孔特征見(jiàn)表2。保衛(wèi)細(xì)胞縱軸長(zhǎng)依次為‘莊薯3號(hào)’（11.66 μm）＞‘隴薯6號(hào)’（11.16 μm）＞‘隴薯14號(hào)’（10.83 μm）＞‘隴薯10號(hào)’（10.47 μm），其中‘莊薯3 號(hào)’顯著高于‘隴薯10號(hào)’，與其他品種差異不顯著。保衛(wèi)細(xì)胞橫軸長(zhǎng)依次為‘莊薯3號(hào)’（8.47 μm）＞‘隴薯6號(hào)’（8.25 μm）=‘隴薯10號(hào)’（8.25 μm）＞‘隴薯14號(hào)’（8.19 μm），各品種間有差異，但差異不顯著。氣孔寬度值最大的是‘隴薯 14 號(hào)’（2.02 μm），顯著高于其他 3 個(gè)品種，其余3 個(gè)品種的氣孔寬度依次為‘隴薯6 號(hào)’（1.98 μm）、‘莊薯3 號(hào)’（1.77 μm）和‘隴薯10 號(hào)’（1.59 μm），他們之間有差異，但互相都未達(dá)到顯著水平。‘莊薯3 號(hào)’氣孔密度值最大（3.49 n/mm），顯著高于其他品種，‘隴薯6 號(hào)’氣孔密度值最?。?.73 n/mm），顯著低于其他品種（‘隴薯14 號(hào)’除外）。葉脈密度依次為‘莊薯3號(hào)’（4.84 n/m）＞‘隴薯6號(hào)’（4.01 n/mm）＞‘隴薯10號(hào)’（3.75 n/mm）＞‘隴薯14號(hào)’（3.70 n/mm），其中‘隴薯10號(hào)’和‘隴薯14號(hào)’之間無(wú)顯著差異，其余品種間差異顯著。

表2 不同馬鈴薯品種葉片氣孔結(jié)構(gòu)的比較Table 2 Comparisons of stomatal structures of different potato variety leaves

2.4 抗旱性比較

由不同馬鈴薯品種葉片特征參數(shù)可以看出，單一指標(biāo)并不能準(zhǔn)確反映不同品種抗旱性的強(qiáng)弱，運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊密度、海綿組織結(jié)構(gòu)疏松度、中脈厚度、氣孔寬度和氣孔密度等抗旱相關(guān)的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加求平均值，綜合評(píng)價(jià)參試品種的抗旱能力（表3），均值越大抗旱性越強(qiáng)，4個(gè)參試品種的抗旱性強(qiáng)弱依次為‘莊薯3號(hào)’＞‘隴薯10號(hào)’＞‘隴薯6號(hào)’＞‘隴薯14號(hào)’。

表3 馬鈴薯葉片9個(gè)指標(biāo)隸屬函數(shù)值及抗旱性綜合評(píng)價(jià)Table 3 Membership function values of nine indexes of potato leaves and comprehensive evaluation of drought resistance

3 討 論

作為與環(huán)境直接接觸的植物器官，葉片是植物對(duì)環(huán)境變化最敏感的器官之一，其形態(tài)特征能夠反映植物對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)能力，因此眾多研究以葉片解剖結(jié)構(gòu)作為評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)[5-9]。研究表明，不同種類(lèi)植物的葉片結(jié)構(gòu)具有明顯的差異[15]，同種植物葉片的解剖結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出明顯的差異[16,17]。在本研究中，4個(gè)馬鈴薯品種葉片均由角質(zhì)層、上表皮、柵欄組織、海綿組織、下表皮和氣孔構(gòu)成。在葉片顯微結(jié)構(gòu)上均具有不同程度的防止水分散失的形態(tài)解剖特征，如上表皮細(xì)胞外附著有不透水的角質(zhì)層，不但可以降低馬鈴薯的過(guò)度蒸騰作用以保持水分，而且通過(guò)其較強(qiáng)的折光性避免過(guò)強(qiáng)日照引起的損傷[18,19]；上下表皮氣孔的均勻分布可以很好地散熱，從而避免因熱害而使原生質(zhì)及葉綠體變性[20,21]。

參試馬鈴薯葉片雖然具有以上共同特征，但不同品種葉片的解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)值之間均顯示出不同程度的差異，表現(xiàn)出各品種在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。關(guān)于葉片解剖結(jié)構(gòu)特征與抗旱性關(guān)系的研究結(jié)果表明，葉片越厚、柵欄組織厚度越大、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)度越大、柵海比值越高，植物的抗旱性越強(qiáng)，反之則抗旱性越差[3,4,22]。本研究中，不同品種葉片厚度在153.62～178.32 μm，其中‘莊薯3號(hào)’最大，‘隴薯6號(hào)’最小，表明從葉片厚度來(lái)看，‘莊薯3號(hào)’的抗旱性最強(qiáng)，‘隴薯6號(hào)’抗旱性最差。‘莊薯3 號(hào)’的柵欄組織厚度和柵海比都最大，‘隴薯14號(hào)’最小，表明從柵欄組織厚度和柵海比來(lái)看，‘莊薯3號(hào)’的抗旱性最強(qiáng)，‘隴薯14號(hào)’最差。海綿組織厚度越大，海綿組織疏松度越大，葉片抗旱性越差[22,23]。不同品種馬鈴薯葉片的海綿組織厚度和海綿組織疏松度分別為67.77～74.55 μm和41.79%～44.35%，海綿組織最厚的是‘莊薯3 號(hào)’，最薄的是‘隴薯6號(hào)’，而海綿組織疏松度最大的是‘隴薯6號(hào)’，最小的是‘莊薯3號(hào)’，如果從海綿組織厚度和海綿組織疏松度分別評(píng)價(jià)，二者體現(xiàn)的抗旱性強(qiáng)弱剛好相反。葉片中脈不僅起支持作用，還主要負(fù)責(zé)水分和養(yǎng)分的輸送與貯存，中脈厚度越大，抵御干旱的能力越強(qiáng)[24]。不同品種的平均中脈厚度為1 084.67 μm，最厚為‘隴薯14號(hào)’，最薄為‘莊薯3號(hào)’，說(shuō)明‘隴薯14號(hào)’抗旱性最強(qiáng)，‘莊薯3號(hào)’抗旱性最差；氣孔作為植物與外界進(jìn)行氣體和水分交換的主要通道，是影響植物光合和蒸騰作用的重要因素，氣孔越密越有利于植物進(jìn)行光合作用；葉脈密度是影響水分運(yùn)輸?shù)闹匾蛩?，葉脈越發(fā)達(dá)，葉片運(yùn)輸水分的能力越強(qiáng)，抗旱性強(qiáng)的品種都具有葉脈密度和氣孔密度高的特征[25,26]。通過(guò)對(duì)4個(gè)品種葉片的氣孔和葉脈進(jìn)行觀(guān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)氣孔密度最大為‘莊薯3號(hào)’，最小為‘隴薯6號(hào)’，分別顯著高于和低于其他品種；葉脈密度最大為‘莊薯3號(hào)’，最小為‘隴薯14號(hào)’，分別顯著高于和低于其他品種；如果從氣孔密度和葉脈密度分別評(píng)價(jià)，二者體現(xiàn)的抗旱性最強(qiáng)的品種一致，均為‘莊薯3號(hào)’，但抗旱性最弱的品種并不一致。

以上分析表明，馬鈴薯葉片各解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)與抗旱性之間并無(wú)絕對(duì)的相關(guān)性，抗旱性的強(qiáng)弱不能完全由單一指標(biāo)體現(xiàn)。隸屬函數(shù)分析方法提供了一種在多指標(biāo)測(cè)定基礎(chǔ)上對(duì)某種特性綜合評(píng)價(jià)的途徑[27]，馬鈴薯葉片解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)蘊(yùn)含眾多的內(nèi)容，為了防止單一指標(biāo)的局限性，利用隸屬函數(shù)分析方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。因此，本研究采用隸屬函數(shù)法對(duì)參試品種的抗旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中葉片厚度、柵欄組織厚度、柵欄組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)度、柵海比和氣孔密度與抗旱性呈正相關(guān)，用公式X（μ1）=（X-Xmin）（/Xmax-Xmin）計(jì)算；海綿組織厚度和海綿組織疏松度與抗旱性呈負(fù)相關(guān)，用公式X（μ2）= 1-（X-Xmin）（/Xmax-Xmin）計(jì)算。綜合評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，參試品種的抗旱性強(qiáng)弱依次為‘莊薯3 號(hào)’＞‘隴薯10 號(hào)’＞‘隴薯6號(hào)’＞‘隴薯14號(hào)’，其中‘隴薯10號(hào)‘’隴薯6號(hào)’和‘隴薯14號(hào)’的抗旱性強(qiáng)弱順序與賈小霞等[28]以PEG脅迫下馬鈴薯幼苗抗逆生理指標(biāo)為評(píng)價(jià)依據(jù)的研究結(jié)果一致。