腐殖酸對土霉素和土壤酶活性交互響應(yīng)研究

權(quán) 剛,仝玉琴,高 瑩,張 潔,楊 迪

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 咸陽 712000)

土壤酶在土壤微生態(tài)活動中扮演重要角色，是土壤重要的有機(jī)組成成分之一，廣泛參與土壤中各類生物化學(xué)作用，具有生物催化能力，如動植物和微生物等殘骸的分解，土壤自身存在的腐殖酸的合成與生理作用等。土壤酶的生物活性反應(yīng)了土壤生物化學(xué)過程的相對強(qiáng)度，如土壤過氧化氫酶、脲酶和磷酸酶全程參與土壤各類元素的生物化學(xué)反應(yīng)及循環(huán)，屬于土壤新陳代謝過程中的催化劑。土壤酶的活性對土壤外源物的影響較為敏感，尤其是污染物，一定程度對土壤酶的生物活性具有破壞性，反之，土壤酶的活性也能夠反應(yīng)土壤受到的污染情況。腐殖酸在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用廣泛，它可以刺激農(nóng)作物的生理代謝，改善農(nóng)作產(chǎn)品籽實(shí)質(zhì)量，改良土壤結(jié)構(gòu)，優(yōu)化化肥各種個性，增強(qiáng)植物自身抗逆性。

課題組擬模擬土霉素污染土壤環(huán)境，設(shè)計不同濃度梯度，通過測定8個周期內(nèi)土壤中過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶的生物活性，分析研究土霉素對土壤污染情況下，土壤酶的生物活性受到的影響情況，探明抗生素土霉素對土壤中微觀層面的生物效應(yīng)，并嘗試使用腐殖酸對土壤生態(tài)環(huán)境進(jìn)行修復(fù)，探索對處理農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境問題的方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腐殖酸，由凱瑞斯農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

土霉素，購于美國默克公司，分子量496.9。

供試土壤，采自咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)習(xí)基地，0～20 cm表層土壤。

1.2 實(shí)驗方法

對采樣土壤作自然風(fēng)干處理，風(fēng)干過2 mm篩后常態(tài)保存，供室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗。試驗前，調(diào)節(jié)供試土樣含水量，按最大田間持水量40%為標(biāo)準(zhǔn)，裝塑封袋內(nèi)，放置生化培養(yǎng)箱中，作暗箱培養(yǎng)一周，培養(yǎng)溫度25℃。

測定前，在土壤樣品中加入土霉素溶液，模擬抗生素污染土壤，配置土霉素濃度梯度為：0.02、0.035、0.065、0.113、0.201 mol OTC L-1，土霉素實(shí)際含量為10、17.8、32.6、56.2、100 mg OTC kg-1，并設(shè)置空白對照。

將試驗土樣稱取250 g加入燒杯中(500 mL)，用蒸餾水調(diào)節(jié)試驗土樣含水量為最大持水量的50%，放置恒溫培養(yǎng)箱中作暗箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃。為了更大程度模擬自然環(huán)境，培養(yǎng)期間，可用差減法補(bǔ)充水分，并適當(dāng)通氣，保持土壤濕度與土壤活性。取培養(yǎng)時長第1天土樣進(jìn)行測定，測定土壤中過氧化氫酶、磷酸酶和脲酶活性，后期按照每隔一周的時長，連續(xù)測定8周。

1.3 項目測定

1.3.1 過氧化氫酶 采用滴定法測定。將待測土樣過1 mm篩，用150 mL三角瓶稱取5 g，加入蒸餾水40 mL，0.3%過氧化氫5 mL。同時設(shè)置空白試驗，在150 mL三角瓶中注入等量蒸餾水和相同0.3%過氧化氫5 mL，但不加土樣。置于往返式搖床上，振蕩30 min，頻率120次·min-1。振蕩結(jié)束后，加入3N硫酸5 mL，待反應(yīng)結(jié)束后，用致密濾紙過濾。取上層濾液25 mL進(jìn)行滴定，用0.1N高錳酸鉀(0.02 mol·L-1當(dāng)量)滴定至微紅色。

土壤過氧化氫酶的生物活性，用單位土重消耗的0.1 N高錳酸鉀毫升數(shù)與對照組試驗測定量的差表示。

1.3.2 脲酶 采用奈氏比色法測定。用250 mL帶塞三角瓶稱取5 g培養(yǎng)土樣,滴入甲苯(抑菌作用)1 mL, 靜置15 min使其充分反應(yīng), 再加入10%尿素溶液10 mL，pH6.7的檸檬酸鹽20 mL,作為緩沖液，用手搖勻后，在恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)定37℃，培養(yǎng)時長24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取上層濾液并過濾,將濾液3 mL置于50 mL容量瓶中, 加入苯酚鈉溶液4 mL，0.9%次氯酸鈉溶液3 mL, 充分搖勻，待顯色20 min后, 用蒸餾水定容至50 mL。在分光光度計上578 nm波長比色測定。

土壤脲酶的生物活性，以培養(yǎng)24 h后每克土壤樣品中所含的NH3-N的毫克數(shù)來表示。

1.3.3 磷酸酶(堿性) 采用磷酸苯二鈉比色法測定。用稱50 mL三角瓶稱取待測土樣5 g，加入甲苯5滴，再加0.5%磷酸苯二納試劑20 mL，充分振蕩后進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，溫度設(shè)定37℃，培養(yǎng)時長2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取上層液進(jìn)行過濾，吸取濾液5 mL置于50 mL容量瓶中，加入pH9.8氯化銨-氫氧化銨0.25 mL，作緩沖液用，加入2%的4-氨基安替比林液0.5 mL，8%鐵氰化鉀0.5 mL,用手充分搖動后，用蒸餾水定容至50 mL。在分光光度計上于510 nm處比色測定。

磷酸酶的生物活性，以培養(yǎng)2 h后，每百克土壤樣品中所含P2O5的毫克數(shù)來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿酶活性影響分析

土壤中的脲酶主要參與土壤氨氮的轉(zhuǎn)化及形成過程，土壤營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)化過程，它的生物活性的高低反應(yīng)了土壤的肥力水平，反之，也能夠反應(yīng)土壤受到污染的程度。從表1可以看出，供試土樣第1天的測定結(jié)果顯示，土壤脲酶的生物活性受到明顯的抑制作用，土霉素濃度的越大，抑制作用越明顯。分別為：3.6%、5.2%、7.8%、7.7%、9.0%。供試土樣第7天的測定結(jié)果顯示，第1周開始土壤脲酶的生物活性受到土霉素的影響最大，抑制程度最高。分別達(dá)到：4.2%、10.0%、26.5%、23.7%、23.4%。供試土樣第14天的測定結(jié)果顯示，第2周開始土壤脲酶的生物活性受土霉素的影響有所減小，抑制的情況開始下降。抑制率分別為：8.5%、10.1%、0.6%、3.5%、4.3%。供試土樣第21天的測定結(jié)果顯示，第3周后土壤脲酶受土霉素影響相比略有下降，整天表現(xiàn)仍為抑制作用。抑制率分別為：3.7%、2.7%、9.9%、1.9%、1.6%。供試土樣第28天的測定結(jié)果顯示，從第4周以后土霉素對土壤脲酶的生物活性不在抑制，表現(xiàn)為刺激作用，第28天的刺激效果分別為：3.0%、0.1%、0.4%、5.0%、4.9%。供試土樣第56天的測定結(jié)果顯示，土霉素對土壤脲酶的生物活性的抑制作用已不再存在，各濃度都顯示刺激作用，刺激效果分別為：0.6%、4.9%、6.5%、4.0%、2.9%。由此可見，土霉素對土壤脲酶的生物活性的影響大致以第4周起程正太分布，前期主要表現(xiàn)為抑制脲酶生物活性，后期主要表現(xiàn)為刺激脲酶的生物活性。

表1 脲酶活性與土霉素濃度及培養(yǎng)時長試驗結(jié)果

2.2 磷酸酶活性影響分析

土壤磷酸酶對于磷在生態(tài)環(huán)境中的循環(huán)起著非常重要的作用，在研究污染物對土壤酶的影響中是研究頻率極高的一種酶。由表2可知，供試土樣第1天的測定結(jié)果顯示，土壤中磷酸酶的生物活性受到土霉素的刺激作用，尤其是最高濃度的土霉素對磷酸酶活性的刺激作用最強(qiáng)，達(dá)到了40.9%。供試土樣第7天的測定結(jié)果顯示，低濃度10 mg·kg-1、17.8 mg·kg-1兩個梯度的土霉素使土壤磷酸酶的生物活性受到抑制，而高濃度的土霉素則刺激磷酸酶的生物活性，濃度越高，刺激作用越強(qiáng)烈。供試土樣第14天的測定結(jié)果顯示，低濃度10 mg·kg-1、17.8 mg·kg-1、31.6 mg·kg-1處理的土霉素對土壤磷酸酶的生物活性產(chǎn)生抑制作用，而高濃度56.2和100 mg·kg-1的土霉素對土壤磷酸酶的生物活性產(chǎn)生刺激作用，但不論是抑制作用還是刺激作用對磷酸酶活性的影響都不顯著。到第21天所有處理下的磷酸酶活性均高于對照，其刺激情況與第3天情況相似。第28天的情況與14天相似。到56天所有土霉素處理磷酸酶活性均低于對照。土霉素對土壤磷酸酶活性的影響作用相對比較明顯，抑制或刺激程度相對較高，前4周表現(xiàn)為刺激土壤磷酸酶的生物活性，以后則表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用。

表2 磷酸酶活性與土霉素濃度及培養(yǎng)時長試驗結(jié)果

2.3 過氧化氫酶活性影響分析

土壤過氧化氫酶是土壤植物微生物等進(jìn)行呼吸作用，有機(jī)物生物化學(xué)氧化反應(yīng)的關(guān)鍵參與者，它的存在，避免各生物反應(yīng)過程中產(chǎn)生的過氧化氫對土壤及生物的危害作用，它的活性既表明土壤生物學(xué)特性，也能指示土壤污染狀況。從表3可知，供試土樣第1天、第7天的測定結(jié)果顯示，土霉素對土壤過氧化氫酶的生物活性有明顯的抑制作用，培養(yǎng)第1天和第7天抑制作用最強(qiáng)烈，且隨著土霉素濃度的增加土壤過氧化氫酶的生物活性降低越明顯。第1天的抑制率為：4.0%、5.3%、5.4%、6.5%、8.6%。第7天的抑制率為：2.6%、4.4%、5.9%、5.9%、7.0%。供試土樣第14天的測定結(jié)果顯示，第2周土壤過氧化氫酶的生物活性基本恢復(fù)到了空白對照水平。供試土樣第21天的測定結(jié)果顯示，從第3周起至培養(yǎng)結(jié)束，土壤過氧化氫酶的生物活性整體上都受到了抑制作用，但抑制作用不強(qiáng)烈，最高為3.3%。由此可見，各濃度梯度土霉素對土壤過氧化氫酶的生物活性影響較為明顯，整體表現(xiàn)為抑制作用，但抑制程度不強(qiáng)烈。

表3 過氧化氫酶活性與土霉素濃度及培養(yǎng)時長試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

通過試驗表明，腐殖酸對土霉素污染的土壤酶活性具有一定的刺激作用。在實(shí)驗室控制條件下，通過模擬自然環(huán)境，測定了6個濃度梯度(含對照)土霉素對8周期內(nèi)，土壤氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性的刺激與抑制情況。試驗表明，土霉素對脲酶活性的影響程正態(tài)分布，具體表現(xiàn)為前期抑制，后期刺激。初步原因分析與土壤中微生物的生長，土霉素碳、氮源形式使得脲酶活性后期被激活恢復(fù)有關(guān)；對土壤磷酸酶表現(xiàn)較為復(fù)雜且持續(xù)時間較長，僅在第1天、第21天各濃度均表現(xiàn)為刺激作用，其余均表現(xiàn)為抑制作用；對土壤過氧化氫酶活性抑制作用較為明顯，并隨時間推移，抑制作用減弱。

研究表明，腐殖酸含有多種活性官能團(tuán)，可以強(qiáng)化作物體內(nèi)過氧化氫酶的活性，刺激植物生理代謝，具有催芽、增根等功能，能夠刺激根系細(xì)胞組織分裂增長，促使植物根量增加，為植物生長提供充足的養(yǎng)分。腐殖酸與土壤中的微量元素能夠形成促進(jìn)植物子實(shí)生長的絡(luò)合物以及螯合物，加強(qiáng)植物根系對糖分、淀粉、蛋白質(zhì)及各種維生素的合成運(yùn)轉(zhuǎn)，加速各種初級產(chǎn)物在子實(shí)中轉(zhuǎn)化積累。腐殖酸能夠增強(qiáng)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，促進(jìn)土壤中好氧細(xì)菌的活性，加快對有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化，提高植物對營養(yǎng)的吸收。腐殖酸中的羥基、酚基等官能團(tuán)，能與有機(jī)化肥更好的作用，可以抑制土壤脲酶的活性，促進(jìn)根系對磷元素的吸收利用，有利于根系和葉面吸收微量元素。腐殖酸有固液兩相，表面活性交大，可增強(qiáng)植物抗旱、保水性，進(jìn)而通過改變細(xì)胞膜滲透性等作用，提高植物吸收養(yǎng)分，減少病蟲害。

關(guān)于腐殖酸在改良土壤環(huán)境及對修復(fù)抗生素污染土壤環(huán)境等方面的作用，我們認(rèn)為具有很高的價值，在深入探索其影響機(jī)制及改良效果等方面亦將是課題組未來研究的主要方向，相關(guān)試驗將在后期課題中繼續(xù)開展。