乙醇對右旋糖酐酶酶解作用的影響

問清江，慕 娟，鄭巧霞，孫曉宇，丁 浩

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)為糖苷水解酶，能夠專一性地水解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，降解為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶在醫(yī)藥、食品、化工等領域具有廣泛應用。右旋糖酐酶可用于齲齒的防治[1]。右旋糖酐酶用于制糖業(yè)，甘蔗汁中的污染微生物將蔗糖轉化為高黏度、高分子量的α-葡聚糖，影響生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質，右旋糖酐酶可以降解去除α-葡聚糖，使蔗糖生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質得以保證。右旋糖酐酶水解高分子右旋糖酐制備低分子藥用右旋糖酐，由于其具有專一性和高效性，可以提高水解效率，降低能耗，改善產(chǎn)品品質?，F(xiàn)有的藥用右旋糖酐生產(chǎn)工藝是腸膜狀明串珠菌發(fā)酵將蔗糖轉化為葡聚糖(右旋糖酐)，利用乙醇沉淀法從發(fā)酵液分離右旋糖酐(粗酐)，右旋糖酐沉淀經(jīng)鹽酸水解分離純化為一定分子量的藥用右旋糖酐產(chǎn)品。粗酐中有乙醇殘留，將右旋糖酐酶引入藥用右旋糖酐生產(chǎn)工藝中替代鹽酸水解高分子右旋糖酐，必須考慮粗酐中的殘留乙醇對右旋糖酐酶水解右旋糖酐的影響。通過對乙醇對右旋糖酐酶酶解反應的影響、乙醇對右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響及不同濃度乙醇對右旋糖酐酶酶解右旋糖酐的影響等研究，為右旋糖酐酶應用于右旋糖酐生產(chǎn)提供一定的技術數(shù)據(jù)和條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 右旋糖酐酶(寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司)。

1.1.2 試劑 葡萄糖(D-(+)-Glucose),Sigma 公司產(chǎn)品；3,5-二硝基水楊酸(CP)；乙醇(AR)；其他試劑為市售分析純。

1.1.3 粗酐(陜西省微生物研究所自制)。

1.1.4 儀器 722分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)；101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；2010A-HT高效液相色譜儀(蘇州貝銳儀器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 乙醇對右旋糖酐酶解反應的影響 在pH5.0，溫度50℃，時間10min的反應條件下，分別以含有0、5%、10%、15%、20%、25%、30%不同濃度乙醇的1%的右旋糖酐作為底物進行右旋糖酐酶解反應，檢測水解液中的還原糖(以葡萄糖計)，以確定乙醇對右旋糖酐酶解反應的影響。

1.2.2 乙醇對右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

1.2.2.1 在4℃條件下乙醇對右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

以5%、10%、15%、20%、25%、30%不同乙醇濃度的溶液分別稀釋右旋糖酐酶(相同的稀釋倍數(shù))，將稀釋酶液放置4℃冰箱24 h，然后測定酶活。

1.2.2.2 乙醇對右旋糖酐酶熱穩(wěn)定性的影響

用2.5%、5.0%、7.5%、10.0%乙醇溶以相同的稀釋倍數(shù)液分別稀釋右旋糖酐酶，在50℃水浴保溫5h，每1h取樣檢測右旋糖酐酶活力，得出殘余酶活而確定乙醇濃度對右旋糖酐酶在50℃條件下穩(wěn)定性的影響。

1.2.3 乙醇對右旋糖酐酶解的影響 右旋糖酐酶在6%右旋糖酐濃度，50℃，乙醇含量分別為2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%和20.0%的條件下水解右旋糖酐，每隔30 min取樣檢測和旋糖酐分子量分布。水解結束后乙醇沉淀、50℃烘干，測定分子量分布。

1.2.4 右旋糖酐酶活力的測定[2]采用DNS法測定右旋糖酐酶活力。配制1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液，分別量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖標準溶液，用蒸餾水補齊1 mL，再加入2 mLDNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm測定光吸收值，繪制葡萄糖標準曲線，得出回歸方程用于葡萄糖含量和右旋糖酐酶活力測定。將酶液用一定pH值的緩沖液適當稀釋后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL1%的右旋糖酐溶液中，50℃準確反應10 min，加入2 mLDNS終止反應，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL；空白對照，0.5 mL1%的右旋糖酐溶液50℃準確反應10 min，先后加入2 mLDNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL。以蒸餾水為對照測定540 nm的吸光值，樣品和空白對照的吸光值之差根據(jù)回歸方程得出反應液中的葡萄糖量，從而確定酶活。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘催化右旋糖酐產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(IU)。

1.2.5 分子量與分子量分布[3]取樣品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜作為供試品溶液。另取4～5個已知分子量的右旋糖酐對照品，依法檢測(2020版《藥典》二部附錄VH)。

2 結果與分析

2.1 乙醇對右旋糖酐酶作用的影響

在pH5.0，溫度50℃，時間10 min的反應條件下，分別以含有5%、10%、15%、20%、25%、30%不同濃度乙醇的1%的右旋糖酐作為底物進行右旋糖酐酶解反應，結果見圖1。底物中乙醇濃度從5.0%～30.0%，右旋糖酐酶解液還原糖(以葡萄糖計)的含量與不含乙醇的對照相比較，無明顯差異，說明在這一反應條件下，乙醇對右旋糖酐酶酶解反應本身無影響。

圖1 乙醇對右旋糖酐酶作用的影響

2.2 乙醇對右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

2.2.1 在4℃條件下乙醇對右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響 右旋糖酐酶在5%～30%乙醇溶液中，4℃放置24h后檢測其殘余酶活力(圖2)，不同濃度乙醇溶液中的殘余酶活力與對照相比較，均沒有明顯差異，說明在4℃條件下，右旋糖酐酶在5%～30%乙醇溶液中相對穩(wěn)定。

圖2 4℃條件下乙醇對右旋糖酐酶穩(wěn)定性的影響

2.2.2 乙醇對右旋糖酐酶熱穩(wěn)定性的影響 右旋糖酐酶用不同濃度的乙醇溶液稀釋20倍后放入50℃水浴保溫5 h，每隔1 h取樣檢測殘存酶活力，結果見圖3。在1 h 取樣時發(fā)現(xiàn)溶液中有沉淀產(chǎn)生，且隨著乙醇濃度的增加沉淀增多，在熱的乙醇溶液(50℃)中造成酶蛋白凝聚變性而失活，乙醇濃度越大，這種現(xiàn)象越嚴重。2.5%乙醇溶液中殘余酶活力隨時間降低的趨勢最緩，乙醇濃度增大變化加快，10.0%乙醇溶液中殘余酶活力降低最快。1 h時，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為73.65%，62.67%，41.58%和31.13%，而無乙醇溶液中的酶活殘存率為93%[4]。5 h時，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為43.83%，30.13%，22.46%和21.47%。在4℃的乙醇溶液(5%～30%)中沒有這種現(xiàn)象發(fā)生，說明乙醇對右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性有影響，因此在用右旋糖酐酶降解右旋糖酐時必須考慮到這一點。

圖3 右旋糖酐酶在乙醇溶液中的熱穩(wěn)定性

2.3 乙醇對右旋糖酐酶解的影響

在右旋糖酐酶解時加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%不同濃度的乙醇，水解進程中取樣檢測右旋糖酐分子量的分布(圖4-圖7)。乙醇濃度為2.5%和5.0%的水解進程與無乙醇相比較(圖4，圖6)，水解趨勢基本一致，2.5h的重均分子量分別為17 092和17 101，與無乙醇重均分子量12 025相比較，同處于10 000～20 000之間，說明在乙醇含量5.0%以下對右旋糖酐的酶解影響較小。乙醇濃度為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%時(圖4-7)，雖然重均分子量隨時間延長降低，但水解度的差異顯現(xiàn)，2.5 h的重均分子量分別為26 050，26 929，25 351、26 416，與無乙醇重均分子量差距進一步擴大，表明乙醇濃度7.5%～15.0%對右旋糖酐酶解的影響處于一個水平，但與5.0%以下比較，影響明顯增大。乙醇濃度為17.5%和20.0%的降解速率明顯變慢(圖5)，水解度降低(圖6-圖7)，2.5 h的重均分子量分別為42 893和95 025，3.0 h的重均分子量分別為31 887和77 759，右旋糖酐酶解液中乙醇濃度為17.5%以上會對水解產(chǎn)生極強地影響。

圖4 不同乙醇濃度右旋糖酐酶解進程(1)

圖5 不同乙醇濃度右旋糖酐酶解進程(2)

圖6 2.5 h不同乙醇濃度水解液中右旋糖酐分子量分布

圖7 3.0 h不同乙醇濃度水解液中右旋糖酐分子量分布

在2.1中右旋糖酐酶酶解反應是底物和酶液分別為0.5 mL，酶解液中的乙醇含量實際是2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%、15.0%，反應時間10 min，在這樣的條件下盡可能避免了右旋糖酐酶在50℃乙醇溶液中凝聚變性活力受損，底物中乙醇濃度在30%以下對右旋糖酐酶作用本身基本沒有影響，乙醇不影響右旋糖酐酶的作用。在2.1中，低溫(4℃)下30%以下的乙醇溶液對右旋糖酐酶的穩(wěn)定性不會產(chǎn)生影響，但是在50℃，2.5%乙醇溶液中右旋糖酐酶在1h時酶蛋白凝聚沉淀產(chǎn)生使酶活力受損，隨著時間的延長，沉淀增加，活力受損增加，隨著乙醇濃度的增加，右旋糖酐酶活力隨時加劇，因此在單純的乙醇溶液中，右旋糖酐酶的熱穩(wěn)定性較差。不同乙醇濃度條件下的右旋糖酐酶解結果表明，2.5%～20.0%乙醇含量雖然不同程度的影響到酶解，但是在相對應的乙醇濃度下沒有單純乙醇溶液中酶活損失而產(chǎn)生的影響大，原因在于，有右旋糖酐的存在，抑制了酶蛋白凝聚變性的產(chǎn)生，減少了右旋糖酐酶活力受損的速率和強度。乙醇對右旋糖酐酶解的影響因乙醇濃度的不同而不同，5.0%以下影響較小，7.5%～15.0%影響在同一的水平，17.5%以上影響加劇。因此，在右旋糖酐酶解工藝過程中，乙醇對右旋糖酐的酶解的影響是可控制的。

3 討論

現(xiàn)有的右旋糖酐原料藥生產(chǎn)工藝是將高分子的右旋糖酐從右旋糖酐發(fā)酵液中用乙醇沉淀分離為粗酐，沉淀直接溶解為一定濃度的右旋糖酐溶液，加入鹽酸水解為一定分子量分布的低分子右旋糖酐，乙醇分離純化為目標分子量分布的藥用右旋糖酐。由于粗酐沒有干燥，一定有乙醇殘存，生產(chǎn)企業(yè)的實際情況是發(fā)酵水平高低、分離提取等因素導致粗酐乙醇殘留高低不同，表現(xiàn)在右旋糖酐水解液中乙醇含量在1.0%～15.0%之間，因此在水解工藝中引入右旋糖酐酶代替鹽酸，必須考慮殘留乙醇對右旋糖酐酶作用的影響。在2.1中的反應條件下，底物中乙醇濃度從5.0%～30.0%的右旋糖酐酶酶解反應表明，右旋糖酐溶液中乙醇含量30.0%以下對右旋糖酐酶酶解反應本身無影響。低溫(4℃)條件下，右旋糖酐酶在30%以下的乙醇溶液中相對穩(wěn)定。在熱的乙醇溶液(50℃)中造成酶蛋白凝聚變性而失活，乙醇濃度越大，這種現(xiàn)象越嚴重，不同的乙醇濃度，右旋糖酐酶活力損失不同，1 h時，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為73.65%，62.67%，41.58%和31.13%，5 h時，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活殘存率分別為43.83%，30.13%，22.46%和21.47%。乙醇對右旋糖酐的酶解影響結果表明，不同乙醇含量影響不同，右旋糖酐酶解液中乙醇含量5%下影響甚微，7.5%～15.0%影響進一步增大，但基本維持在同一的水平，17.5%以上影響劇烈，因此需要在右旋糖酐酶解時根據(jù)粗酐乙醇殘留不同，采用不同的工藝條件參數(shù)，同時需要加強發(fā)酵等上游工藝條件控制，盡可能的使粗酐中的乙醇殘留穩(wěn)定在一定范圍，從而保證右旋糖酐的酶解。右旋糖酐酶替代鹽酸水解右旋糖酐生產(chǎn)右旋糖酐原料藥，雖然粗酐中的乙醇殘留會影響右旋糖酐酶的作用，但是是可以控制的。畢竟右旋糖酐酶具有的專一性、高效性等特點，使得右旋糖酐水解溫度從90～95℃降低到50℃，大大降低能耗，不增加原材料的費用，避免了鹽酸使用對設備的特殊要求和環(huán)保負荷，改善產(chǎn)品品質?？傊倚囚赣糜谟倚囚纤幍纳a(chǎn)具有良好的前景。