土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的熏蒸、觸殺與驅(qū)避活性

(楊悅玲 余晚霞 李敬丹 李春燕 王 凱 梁 倩

(西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室；西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224)

谷蠹Rhizoperthadominica(Fabricius)屬鞘翅目(Coleoptera)長蠹科(Bostrichidae)谷蠹屬(Rhyzopertha)昆蟲，是一種世界性分布的蛀蝕性儲物害蟲，熱帶和亞熱帶地區(qū)發(fā)生最多，尤以華南、華中地區(qū)發(fā)生最為嚴(yán)重，是我國水稻和小麥等谷物的重要倉儲害蟲[1]。

米象Sitophilusoryzae(Linnaeus)屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)昆蟲，為世界性重要儲糧害蟲，其寄主范圍廣、繁殖力強、世代重疊和抗逆性強[2]，對多種谷物及其加工品、豆類、油料、干果、藥材均可造成嚴(yán)重危害[3]。

儲糧害蟲不僅導(dǎo)致儲糧數(shù)量及質(zhì)量下降，威脅我國糧食安全，而且儲糧害蟲的排泄物、尸體導(dǎo)致糧食發(fā)熱、發(fā)霉、產(chǎn)生異味，嚴(yán)重危害消費者的身心健康[4]。目前，防治儲糧害蟲主要采用殺蟲松和甲基嘧啶磷等化學(xué)防護劑及磷化氫和溴甲烷等熏蒸劑。在長期單一使用下，儲糧害蟲對多種類型的農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性[5]，糧食品質(zhì)下降，食品安全風(fēng)險增加[6]?；瘜W(xué)防治已無法滿足人們對生態(tài)環(huán)保、綠色高效、安全無污染的需求。植物次生代謝產(chǎn)物是植物與昆蟲協(xié)同進化過程中為抵御昆蟲的植食行為產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，作用于昆蟲的神經(jīng)、呼吸、消化、內(nèi)分泌等多個系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)新穎，靶點多樣，不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是開發(fā)安全高效儲糧殺蟲劑的重要來源[7]。植物揮發(fā)油是小分子，容易揮發(fā)的脂溶性物質(zhì)，穿透能力強，可破壞昆蟲的體壁結(jié)構(gòu)，溶解角質(zhì)層，促進活性組分的滲透、吸收[8]，適合在密閉空間內(nèi)通過熏蒸、觸殺及驅(qū)避的方式實現(xiàn)對儲糧害蟲復(fù)雜多樣的生物活性和良好的殺蟲效果。

土荊芥(Dysphaniaambrosioides(Linnaeus) Mosyakin & Clemants)是藜科(Chenopodiaceae)藜屬(Chenopodium)植物，一年生或多年生草本，原產(chǎn)熱帶美洲[9]，現(xiàn)已廣泛分布于我國大部分地區(qū)，通過釋放化感物質(zhì)影響周圍植物的生長發(fā)育，威脅入侵地的生物多樣性，被列入外來入侵物種名錄[10]。對土荊芥的開發(fā)利用，是解決土荊芥危害的主要途徑之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)土荊芥揮發(fā)油對儲糧害蟲巴西豆象(Zabrotessubfasciatus)[11]、綠豆象(Callosobruchuschinensis)[12,13]、菜豆象(Acanthoscelidesobtectus)[12]、谷象(Sitophilusgranarius)[12]、大谷蠹(Prostephanustruncatus)[12]、四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)[13,14]和玉米象(Sitophiluszeamais)[15]具有熏蒸活性。對玉米象[15]、大谷蠹(Prostephanustruncatus)[16]、谷斑皮蠹(Trogodermagranarium)[16]、綠豆象[17]和四紋豆象[17]具有觸殺活性。對巴西豆象[11]、綠豆象[13]和四紋豆象[13]具有驅(qū)避活性。黃九玲等[18]研究發(fā)現(xiàn)土荊芥乙醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚粗提物對谷蠹具有明顯的觸殺活性，乙醇和丙酮提取物具有顯著的熏蒸活性。土荊芥揮發(fā)油對綠豆象、四紋豆象、大豆象、谷象、玉米象和大谷蠹的殺蟲活性要優(yōu)于葉子粉末的殺蟲活性，認為葉子殺蟲活性是其所含揮發(fā)油所致[12]。目前鮮有土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的熏蒸、觸殺及驅(qū)避活性的報道。本研究以谷蠹和米象為靶標(biāo)，測試土荊芥揮發(fā)油的殺蟲活性，為入侵植物土荊芥開發(fā)為植物源農(nóng)藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土荊芥樣品

土荊芥地上部分于2019年5月采自云南省昆明市宜良縣，經(jīng)度：103°3′43″，緯度：24°58′27″，海拔：1 742 m，陰干備用。

1.1.2 谷蠹的培養(yǎng)條件

供試谷蠹蟲源由河南省南陽市淅川縣渠首天然趣味昆蟲植物館提供，根據(jù)文獻[19]的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。溫度27～29 ℃，相對濕度70%～80%，光照周期L∶D=16 h∶8 h，用小麥飼養(yǎng)，置于養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)7 d 后，篩去成蟲，待新一代成蟲羽化大量出現(xiàn)10 d左右，篩出成蟲作為試蟲。

1.1.3 米象的培養(yǎng)條件

供試米象蟲源由西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護與利用學(xué)院昆蟲學(xué)實驗室提供，根據(jù)文獻[20]的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。恒溫培養(yǎng)箱：溫度24～27 ℃，相對濕度55%～65%，光照周期L∶D=16 h∶8 h，用大米飼養(yǎng)，置于養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)7 d 后，篩去成蟲，待新一代成蟲羽化大量出現(xiàn)一周左右，篩出成蟲，作為試蟲。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

將新鮮的土荊芥樣品剪碎陰干，放入2 000 mL的圓底燒瓶中，加適量水，用揮發(fā)油提取器提取，水蒸氣蒸餾5 h，得到淺黃色油狀物，冷凍干燥，配成不同濃度的溶液，4 ℃保存?zhèn)溆肹21]。

1.2.2 熏蒸活性的測定

參照[22,23]的方法測定土荊芥發(fā)油對谷蠹和米象的熏蒸活性。通過預(yù)試驗確定測試濃度范圍。用正己烷將土荊芥揮發(fā)油稀釋成5、2.5、1.25、0.625、0.313 mg/mL 5個不同濃度梯度的溶液備用。將10頭供試?yán)ハx放入直徑2.5 cm，高5.5 cm，體積25 mL的玻璃瓶中，將直徑2.0 cm的濾紙用固體膠粘在瓶蓋上，吸取10 μL不同濃度的溶液均勻滴在的濾紙片上，揮發(fā)20 s后，迅速擰緊瓶蓋密封形成密閉空間。正己烷為陰性對照，每組處理重復(fù)5次。處理后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后分別檢查各組試蟲死亡頭數(shù)，利用公式(1)和(2)計算死亡率和校正死亡率。用SPSS統(tǒng)計軟件計算致死中濃度LC50(mg/L)。

死亡率=死亡蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%

(1)

校正死亡率= [(處理組死亡率-對照度死亡率)/(1-對照度死亡率) ]×100%

(2)

1.2.3 觸殺活性的測定

參照文獻[22,23]微量點滴方法，測定土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的觸殺活性。通過預(yù)試驗確定測試濃度范圍，用正己烷將土荊芥揮發(fā)油稀釋成5個不同質(zhì)量濃度梯度的溶液備用。點滴法觸殺谷蠹時土荊芥的質(zhì)量濃度：160、80、40、20、10 mg/mL；觸殺米象時土荊芥的質(zhì)量濃度：112.50、56.25、28.13、14.06、7.03 mg/mL。用移液器取0.50 μL不同質(zhì)量濃度的溶液滴在谷蠹和米象的前胸背板上，每個質(zhì)量濃度處理10只試蟲，重復(fù)5次，處理后轉(zhuǎn)移到直徑2.5 cm，高度5.5 cm的玻璃瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。正己烷做陰性對照，甲氰菊酯做陽性對照。24 h后分別檢查各組試蟲死亡情況，用式(1)和式(2)計算死亡率和校正死亡率。用SPSS統(tǒng)計軟件計算致死中量LD50(μg/頭)。

1.2.4 驅(qū)避活性的測定

參照文獻[23]的方法測定土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的驅(qū)避活性，略有改動。通過預(yù)實驗確定測試濃度范圍。將土荊芥揮發(fā)油用正己烷稀釋成12.5、2.5、0.5、0.1、0.02 mg/mL 5個不同質(zhì)量濃度梯度的溶液備用。將直徑9 cm的圓形濾紙對稱裁開，用固體膠貼在9 cm培養(yǎng)皿底部。用移液槍取正己烷溶液300 μL均勻滴在其中一半濾紙上，并用鉛筆在角上畫圈標(biāo)記，再用移液槍吸取土荊芥揮發(fā)油不同濃度的樣品溶液300 μL，均勻滴在另一半濾紙上，揮發(fā)30 s后，將20頭谷蠹和米象分別轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中央，套上絲襪，外用保鮮膜包住，用橡皮筋扎緊，用針在保鮮膜上扎孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使試蟲自然分散。正己烷和避蚊胺(DEET：N，N-diethyl-3-methylbenzamide)分別作為陰性對照和陽性對照。每個質(zhì)量濃度重復(fù)5次。分別在接蟲2、4 h時觀察濾紙上試蟲分布情況，用式(3)計算驅(qū)避率。

驅(qū)避率=[(Nc-Nt)/(Nc+Nt)] ×100%

(3)

式中：Nc為出現(xiàn)在正己烷陰性對照區(qū)域的試蟲數(shù)量；Nt為出現(xiàn)在不同濃度土荊芥溶液區(qū)域的試蟲數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的熏蒸活性

由表1可以看出，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹熏蒸活性LC50為1.07 mg/L(1.07 μL/L，土荊芥揮發(fā)油的密度為0.998 g/mL)，與其他文獻報道的運用類似室內(nèi)生物測定的揮發(fā)油相比，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹表現(xiàn)出更明顯的熏蒸活性。如檸檬(Citruslimon)[25]果實，留蘭香(Menthaspicata)[26]葉子，藍桉(Eucalyptusglobules)[27]葉子，大蒜素(Alliumsativum)[27]，荔枝蝽(Tessartornapapillosa)[28]臭液，小茴香(Foeniculumvulgare)[29]種子，八角茴香(Fructusanisistellati)[29]種子，辣根素I和辣根素II[30]對谷蠹熏蒸活性LC50分別為522.868、7.398、7.208、4.565、6.313、4.02、2.88、2.67、1.95 μL/L?？梢钥闯鐾燎G芥揮發(fā)油對谷蠹的熏蒸活性優(yōu)于現(xiàn)有文獻報道的其他植物揮發(fā)油。

表1 土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的熏蒸活性

土荊芥揮發(fā)油對米象的熏蒸活性LC50為0.56 mg/L(0.56 μL/L)。薄荷(Menthaarvensis)[31]葉子、穗花牡荊(Vitexpseudo-negundo)[32]葉子、赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)[33]葉子、馬纓丹(Lantanacamara)[33]葉子、姜黃(Curcumalonga)[34]葉子、小茴香(Cuminumcyminum)[35]種子，波斯百里香(Thymuspersicus)[36]葉子、蒔蘿Anethumgraveolens)[35]種子、香菜(Carumcarvi)[35]種子、細葉糙果芹(Carumcopticum)[37]種子、荔枝蝽(Tessartornapapillosa)[28]臭液、小葉薄荷(Menthamicrophylla)[33]葉子對米象的熏蒸活性LC50分別為45.5 μL/L、31.96 μL/L、30.81 μL/L、29.47 μL/L、11.36 mg/L、4.75 mg/L、3.34 μL/L、3.29 mg/L、2.45 mg/L、0.91 μL/L、0.48μL/L、0.21 μL/L。土荊芥揮發(fā)油對米象的熏蒸活性優(yōu)于大多數(shù)揮發(fā)油的活性，但是不及荔枝蝽臭液和小葉薄荷葉子揮發(fā)油的活性。

2.2 土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的觸殺活性

由表2可以看出，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹觸殺活性LD50為16.09 μg/頭，與陽性對照甲氰菊酯相比，土荊芥揮發(fā)油未表現(xiàn)出更強的毒性。但與僅有的文獻報道，灰毛豆(Tephrosiapurpurea)[38]樹皮、種子和葉子的揮發(fā)油對谷蠹五齡若蟲LD50分別為25.0、27.9、27.8 mg/頭相比，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹的觸殺活性優(yōu)于灰毛豆樹皮、種子和葉子揮發(fā)油的活性。

表2 土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的觸殺活性

土荊芥揮發(fā)油對米象觸殺活性的LD50為9.62 μg/頭，與陽性對照甲氰菊酯LD50為12.93 μg /頭和文獻報道的龍舌蘭(Agaveamericana)[20]葉子脂溶性成分烷烴對米象觸殺活性LD50為10.55 μg /頭相比，土荊芥揮發(fā)油表現(xiàn)出更強的觸殺毒性。

2.3 土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的驅(qū)避活性

土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的驅(qū)避活性結(jié)果見表3。土荊芥揮發(fā)油對谷蠹的驅(qū)避活性：在最大濃度為58.975 μg/cm2時，處理2 h，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹的驅(qū)避率為64%，與陽性對照避蚊胺的驅(qū)避率66%接近；處理4 h，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹的驅(qū)避率為82%，優(yōu)于避蚊胺的驅(qū)避率66%。土荊芥揮發(fā)油對米象的驅(qū)避活性：在最大濃度為58.975 μg/cm2時，處理2 h和4 h，對米象的驅(qū)避率分別為33%和55%，均優(yōu)于陽性對照避蚊胺的驅(qū)避率13%和18%。從以上數(shù)據(jù)可以看出，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象兩種倉儲害蟲具有良好驅(qū)避活性。

表3 土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的驅(qū)避活性

3 討論

揮發(fā)油的化學(xué)成分是其殺蟲活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，土荊芥揮發(fā)油的化學(xué)成分隨產(chǎn)地不同而不同。本實驗所用土荊芥采自云南省昆明市，揮發(fā)油相對含量較高的成分有：(+)-4-蒈烯(36.136%)、2-蒈烯(23.897%)、鄰傘花烴(10.992%)、驅(qū)蛔素環(huán)氧化物(9.047%)、驅(qū)蛔素(4.882%)等?？溌∥鞑縖12]土荊芥揮發(fā)油的主要成分為傘花烴(cymol，50.0%)、α-松油烯(α-terpinen，37.6%)、驅(qū)蛔素(ascaridole，3.5%)、香芹酚(carvacrol，3.3%)和cis-β-法呢烯(cis-β-farnesen，1.4%)。印度戈勒克布爾[39]地區(qū)土荊芥揮發(fā)油的主要成分為驅(qū)蛔素(ascaridole，38.03%)、α-松油烯(α-terpinene，37.74%)、對傘花烴(p-cymene，16.7%)、異驅(qū)蛔素(isoascaridole，2.55%)和檸檬烯(limonene，1.90%)?；瘜W(xué)成分的差異性導(dǎo)致殺蟲活性的差異性。土荊芥揮發(fā)油成分顯著差異的主要原因可能是由于生境、采收時間及采集部位的不同。

土荊芥對儲糧害蟲不僅具有熏蒸、觸殺與驅(qū)避活性，還會影響害蟲的產(chǎn)卵和發(fā)育。Tapondjou等[12]研究發(fā)現(xiàn)土荊芥葉子粉末分別與玉米、麥子、豌豆、綠豆和白豆混合，質(zhì)量濃度從1.6%～6.4%分別作用于玉米象、大谷蠹、谷象、綠豆象、四紋豆象和菜豆象，均顯著抑制害蟲產(chǎn)卵和成蟲羽化。Pandey等[17]研究發(fā)現(xiàn)土荊芥揮發(fā)油1%和5%的丙酮溶液與木豆種子混合，100%抑制綠豆象和四紋豆象成蟲在木豆種子上產(chǎn)卵且沒有羽化成蟲出現(xiàn)。用10%土荊芥揮發(fā)油丙酮溶液進行植物毒性試驗，處理過的木豆種子發(fā)芽率為75%，與對照組發(fā)芽率79%比較無顯著差異。處理和未處理的木豆種子儲藏6個月后進行感官評價，發(fā)現(xiàn)處理過的木豆種子無論從外觀色澤、風(fēng)味、口感等方面均優(yōu)于未經(jīng)處理的木豆種子，更受消費者的歡迎。

揮發(fā)油中含有的單萜類化合物，使其具有殺蟲活性、熏蒸活性、抑制昆蟲產(chǎn)卵及抑制昆蟲生長發(fā)育的主要原因[17]。Pollack等[40]研究發(fā)現(xiàn)驅(qū)蛔素是土荊芥揮發(fā)油殺瘧原蟲的活性成分。Chu等[15]研究了產(chǎn)自福建省土荊芥揮發(fā)油中含量最高的三種化合物驅(qū)蛔素[(Z)-ascaridole，29.7%]，異驅(qū)蛔素(isoascaridole，13.0%)和對傘花烴(ρ-cymene，12.7%)對玉米象的熏蒸與觸殺活性，發(fā)現(xiàn)驅(qū)蛔素的熏蒸與觸殺活性均優(yōu)于土荊芥揮發(fā)油，是主要活性成分。本實驗所用土荊芥中驅(qū)蛔素含量較低，(+)-4-蒈烯和2-蒈烯含量較高，后續(xù)研究應(yīng)采用活性追蹤的方法對土荊芥揮發(fā)油中殺谷蠹和米象的活性成分進行殺蟲活性評價，確定殺蟲機理。

4 結(jié)論

土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象的熏蒸活性，與目前文獻報道的運用類似方法測定的揮發(fā)油活性相比，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹表現(xiàn)出良好的熏蒸活性，對米象的熏蒸活性優(yōu)于大多數(shù)揮發(fā)油的活性，但是不及荔枝蝽臭液和小葉薄荷葉子揮發(fā)油的活性。植物揮發(fā)油對谷蠹和米象觸殺活性文獻報道較少，土荊芥揮發(fā)油對谷蠹的觸殺活性優(yōu)于目前文獻報道的灰毛豆樹皮、種子和葉子揮發(fā)油的活性。土荊芥揮發(fā)油對米象的觸殺活性優(yōu)于陽性對照甲氰菊酯和龍舌蘭葉子脂溶性烷烴成分對米象的觸殺活性。土荊芥揮發(fā)油對谷蠹和米象具有良好的驅(qū)避活性。倉儲害蟲的熏蒸劑和防護劑已產(chǎn)生不同程度的抗藥性，因此尋找兼有化學(xué)農(nóng)藥的速效性和生物農(nóng)藥安全性的高效低毒生物農(nóng)藥已刻不容緩，入侵植物土荊芥的開發(fā)與利用為解決這一難題提供了科學(xué)參考。