上海市普陀區(qū)白紋伊蚊抗性監(jiān)測與機(jī)制探索

張石昊 徐 宏 夏斯偉 張 亮 張柳穎 周毅彬

(1.上海市普陀區(qū)疾病預(yù)防控制中心消毒病媒科，上海 200333；2.上海市疾病預(yù)防控制中心傳染病防治所，上海 200336)

白紋伊蚊Aedesalbopictus是上海市唯一的登革熱媒介蚊種(朱江等，2018)，由于全球旅游行業(yè)的發(fā)達(dá)，每年來自登革熱疫區(qū)國家的輸入性病例對于上海登革熱疫情的防控有著不小的壓力。登革熱疫情的控制主要依賴于使用化學(xué)藥物使環(huán)境成蚊密度快速降低(Bradyetal., 2020)，因此藥物的選擇以及蚊蟲的抗藥性會影響登革熱疫情控制效果。根據(jù)上海市登革熱應(yīng)急處置工作方案，擬除蟲菊酯類藥物依然是登革熱防控的主要?dú)⑾x劑。然而，監(jiān)測顯示(劉洪霞等，2020)上海市登革熱媒介蟲種白紋伊蚊已經(jīng)對多種除蟲菊酯類藥物產(chǎn)生一定水平抗性，且隨著時間推移呈顯著上升趨勢，此外，擬除蟲菊酯與雙硫磷、殘殺威等殺蟲劑存在的交互抗性(Yuntaetal., 2019)也對精準(zhǔn)選擇殺蟲劑影響巨大。

蚊蟲對于殺蟲劑的抗性通常被認(rèn)為來源于殺蟲劑對于蚊蟲種群的高度篩選，在這種長期的篩選壓力下，抗性這一遺傳性狀在蚊蟲種群中固定并保留(Liu, 2015)?？剐詸C(jī)制的產(chǎn)生主要包括(Nkyaetal.,2013)代謝抗性、靶點(diǎn)抗性、穿透力改變和行為抗性4類。對白紋伊蚊抗性的研究開展相對較晚，直到2003年泰國首次報道了白紋伊蚊對于有機(jī)氯殺蟲劑DDT的高抗性(Somboonetal., 2003)，2011年首次報道了白紋伊蚊kdr基因上的有義突變(Kasaietal.,2011)，2015—2018年，我國也逐漸報道在F1534位點(diǎn)上發(fā)生不同突變的蚊蟲種群，但在其他可能發(fā)生變異的位點(diǎn)報告較少(Xuetal., 2016; Lietal., 2018; Gaoetal., 2018)。家蠅中kdr基因已被確認(rèn)為擬除蟲菊酯類殺蟲劑的目標(biāo)靶點(diǎn)，但是不同位點(diǎn)突變對于不同種類除蟲菊酯的抗性影響有著較大的差別(Yanetal., 2020)。

1 材料與方法

1.1 白紋伊蚊樣本采集

白紋伊蚊幼蟲和成蟲樣本于2019年采集自上海市普陀區(qū)5所不同的居民區(qū)，包括長風(fēng)四村(CF)、真如西村(ZR)、新會苑(XH)、師大一村(SD)和東新路小區(qū)(DX)。DX從未開展化學(xué)措施處置蚊蟲，ZR和XH每年均開展夏季蚊蟲控制，使用菊酯類殺蟲劑進(jìn)行蚊蟲密度控制。白紋伊蚊幼蟲采自相應(yīng)區(qū)域的不同孳生地，例如輪胎、花盤托盆、容器等。成蟲則采用人誘法，使用吸蚊器吸取。將采集到的蚊蟲帶回上海市普陀區(qū)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為(26±1)℃和RH 65%±5%，幼蟲培養(yǎng)至成蟲后繁殖一代，成蟲則直接繁殖一代，F(xiàn)1代成蟲用于藥敏試驗(yàn)。

1.2 殺蟲劑抗性測定

研究采用WHO推薦的接觸筒法(WHO, 2016), 由于WHO對于白紋伊蚊的診斷劑量推薦不夠確切，除其提供的部分診斷劑量以外，WHO建議可以依照敏感品系LC99的兩倍濃度作為診斷劑量(WHO, 2016)，因此本研究根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心建議，參考文獻(xiàn)(高景鵬，2018；Wangetal., 2017)的研究，診斷劑量選擇殘殺威(0.05%)、高效氯氰菊酯(0.4%)和氯菊酯(3%)。實(shí)驗(yàn)取羽化后3～5日齡未吸血雌性白紋伊蚊分別置于含殘殺威(0.05%)、高效氯氰菊酯(0.4%)和氯菊酯(3%)標(biāo)準(zhǔn)藥膜的接觸筒中，每種藥物設(shè)立4個實(shí)驗(yàn)組和3個空白對照組，藥膜均由中國疾病預(yù)防控制中心提供。測試結(jié)束后，將活的蚊蟲速凍致死，所有測試蚊蟲置于95%乙醇之中，用于之后的DNA分析。

白紋伊蚊成蟲抗性判定標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T 26347—2010《蚊蟲抗藥性檢測方法 生物測定法》：實(shí)驗(yàn)組成蚊死亡率≥98.0%為敏感種群; 80.0%～97.9%為可疑抗性種群; <80.0%為抗性種群。對照組死亡率<5%，無需校正; 死亡率5%～20%，實(shí)驗(yàn)組的死亡率以Abbott 公式進(jìn)行校正; 死亡率>20%，則需重新測試。

1.3 酶活性測試

測試羧酸酯酶和P450S兩種酶活性，選擇F1代3～5日齡未吸血的雌性成蟲。通過測定每個樣品的平均吸光度，將測試蚊蟲個體酶活性轉(zhuǎn)化為基于該蚊蟲個體提取出蛋白質(zhì)總量的標(biāo)化值。采用BCA法測定樣品蛋白質(zhì)總量，參照文獻(xiàn)測定羧酸酯酶(Hosokawaetal., 2002)和P450S酶系(Brogdonetal., 1997)的活性。選取不同地區(qū)健康未吸血蚊蟲雌蟲各20只進(jìn)行測定。參照BCA蛋白濃度試劑盒(北京Solrbio公司)說明測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)對照，使用分光光度法進(jìn)行測定，儀器為紫外/可見分光光度計(Cary50，美國Agilent公司)。

羧酸酯酶的活性以α-乙酸萘酯為底物進(jìn)行測試，體系為300 μL酶液與300 μL α-乙酸萘酯溶液(14 mg α-乙酸萘酯：5 mL丙酮：20 mL PBS緩沖液),25 ℃水浴下反應(yīng)15 min，加入300 μL 固藍(lán)溶液(50 mg fast blue溶于50 mL PBS緩沖液)，然后25 ℃水浴放置5 min，測定595 nm下的吸光度，重復(fù)3次剔除異常值后取平均值。用α-乙酸萘酚作為校準(zhǔn)酶活性的標(biāo)準(zhǔn)，測定其0～13 μg范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。NSE的比活力采用nmol的α- NAPHTHOL/(min·mg pr)評價。

圖1 接觸筒法測定各地區(qū)白紋伊蚊對三種殺蟲劑死亡率Fig. 1 The mortality of Aedes albopictus 5 fields populations using the WHO tube bioassayA. 殘殺威；B.高效氯氰菊酯；C. 氯菊酯。虛線是80%死亡率，實(shí)線為98%死亡率，死亡率低于98%說明該地區(qū)蚊蟲存在可能抗性，低于80%說明該地區(qū)蚊蟲存在確切抗性。A. Propoxur; B. Beta-cypermethrin; C. Permethrin. Dotted line represents mosquitoes′mortality at 80%, black lines as 98%. 98% mortality rate was the threshold for suspected resistance, and 80% mortality rate was the threshold for confirmatory resistance.

P450S酶系的測定則以3,3-,5,5-甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMBZ)為底物模型，采用細(xì)胞色素C(cyt c美國sigma公司)為標(biāo)化品進(jìn)行了測定。體系為300 μL酶液，600 μL TMBZ溶液(2 mg TMBZ：1 mL甲醇：5 mL pH=5.0醋酸鈉緩沖液)和25 μL 3% H2O2。室溫中反應(yīng)5 min后測定630 nm下的吸光度。以細(xì)胞色素C為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相應(yīng)樣品中的酶活力。酶活力單位為nmol cyt c/mg pr。

1.4 kdr基因突變測定

參照文獻(xiàn)方法(Kasaietal., 2011)檢測白紋伊蚊鈉離子通道蛋白VGSC中處于結(jié)構(gòu)域II、III和IV中的可能突變位點(diǎn)，包括S989、I1011、v1016、F1534、D1763等(Xuetal., 2016；Auterietal., 2018 )。提取接觸筒抗性檢測的白紋伊蚊的基因組DNA，依據(jù)基因組DNA提取試劑盒說明書(QIAamp DNA Mini KIT)進(jìn)行操作，PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)(Kasaietal. 2011)的方法對鈉離子通道蛋白基因相應(yīng)結(jié)構(gòu)域片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為aegSCF20、aegSCR21、aegSCF7、aegSCR7、aegSCF6和aegSCR8，反應(yīng)條件依照文獻(xiàn)(高景鵬，2018)研究。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖電泳凝膠進(jìn)行復(fù)核，然后送上海伯杰生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序，測序引物同樣參照文獻(xiàn)(Kasaietal. 2011)為aegSCR22，aegSCR8和albSCF8。使用MEGA v.5.2軟件對所得序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 白紋伊蚊抗藥性

研究測定了5處居民區(qū)白紋伊蚊對于殘殺威(0.05%)、高效氯氰菊酯(0.4%)和氯菊酯(3%)的抗藥性，死亡率如圖1所示。其中白紋伊蚊對于殘殺威(0.05%)的死亡率范圍為89.87% (SD)～100.00%(CF,ZR,DX)，除SD和XH地區(qū)的白紋伊蚊為可疑抗性以外，其余3處均為敏感；對于高效氯氰菊酯的死亡率范圍為40.32%(SD)～100.00%(DX)，除DX地區(qū)抗藥性為敏感以外，其余4處白紋伊蚊均存在抗性;對于氯菊酯而言死亡率范圍為70.33%(SD)～96.92%(CF),除SD地區(qū)以外，其余4處均為可疑抗性。三種殺蟲劑中，高效氯氰菊酯的平均死亡率最低。SD地區(qū)采集的蚊蟲種群對于3種殺蟲劑的死亡率在5個地區(qū)中均最低，而DX地區(qū)的白紋伊蚊對于測試藥物幾乎不存在抗藥性。

2.2 白紋伊蚊酶活性

5處居民區(qū)白紋伊蚊的羧酸酯酶活性如圖2所示，DX地區(qū)白紋伊蚊的羧酸酯酶活性低于其余4處(PMAX=0.001)，XH地區(qū)活性則顯著高于其他4處(PMAX=0.029)，其余3處地區(qū)間羧酸酯酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(PMIN=0.385)。5處居民區(qū)白紋伊蚊MFOS活性，SD地區(qū)最高，且高于DX(P<0.001)、CF(P<0.001)和ZR(P=0.033)，DX地區(qū)同樣是所有地區(qū)中酶活性最低的地區(qū)并僅與ZR地區(qū)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.249)。

圖2 普陀區(qū)5個地區(qū)白紋伊蚊雌蚊酶活性水平Fig. 2 Enzymes activity of detoxification enzymes and no-specific esterase in adult Aedes albopictus from Putuo, ShanghaiA.非特異性酯酶；B. 單氧化酶。每個條形圖由該地區(qū)蚊蟲酶活性的均數(shù)及95%CI構(gòu)成，*代表與對照組(DX)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。A. No-specific esterase; B. Detoxification enzymes. Error bar is the standard error of the mean. An asterisk (*) indicates a significant difference between the population and the control population (DX) at P < 0.05.

由于除SD地區(qū)外，所有種群對殘殺威的抗性無明顯差別，故將其他4處數(shù)據(jù)合并，結(jié)果顯示SD地區(qū)蚊蟲抗性(P<0.001)、MFOs酶活性(P=0.001)與其余地區(qū)有統(tǒng)計學(xué)意義，NSE酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.466)，提示對于SD地區(qū)蚊蟲的殘殺威抗性更高可能與其MFOS酶活性呈正相關(guān)。而對于高效氯氰菊酯，4處抗性均高于DX地區(qū)的白紋伊蚊，同時NSE酶活性和除ZR地區(qū)以外的MFOs酶活性亦均高于DX地區(qū)，提示CF、SD、XH地區(qū)高效氯氰菊酯的相對高抗可能是由兩種酶活性升高的共同作用產(chǎn)生，而ZR地區(qū)的相對高抗性則可能僅由NSE酶活性升高引起。SD地區(qū)和ZR地區(qū)的白紋伊蚊對氯菊酯的抗性顯著高于包括DX在內(nèi)的其余3處，但這兩個地區(qū)的NSE酶活性與除了DX外的其他地區(qū)無顯著差異，意味著NSE酶活性可能并不是導(dǎo)致這些地區(qū)氯菊酯抗性差異的原因。SD地區(qū)的MFOs酶活性顯著高于除XH外其他地區(qū)，提示MFOs酶活性水平升高可能是引起SD地區(qū)氯菊酯高抗性的主要因素。

整體而言，DX地區(qū)兩種酶活性最低，而SD地區(qū)MFOs酶活性最高的，這可能使得該地區(qū)對菊酯類殺蟲劑抗性更加的明顯，而這種高水平的酶活性可能也對其殘殺威的抗性產(chǎn)生了一定影響。ZR地區(qū)則是唯一MFOs酶活性沒有高于DX的地區(qū)，然而它對于菊酯類的抗藥性卻依然更高。其余2處CF和ZR對于殘殺威的抗性與DX地區(qū)持平，對于菊酯類藥物的抗性處則于中間水平，NSE和MFOs酶活性亦均高于DX地區(qū)，即這兩個地區(qū)對于菊酯類的抗性的升高可能由兩種酶活性水平升高共同影響，同時這并未引起這兩個地區(qū)蚊蟲對于殘殺威抗性的增加。

2.3 kdr基因突變頻率

通過一代測序檢測了5個種群的白紋伊蚊VGSC基因中結(jié)構(gòu)域II、III、 IV上的部分序列，僅I1532和F1534兩個位點(diǎn)檢測到有義突變。在發(fā)現(xiàn)突變的兩個位點(diǎn)上，各發(fā)現(xiàn)一種突變型，即I1532 T和F1534 S，這兩種突變等位基因在5個種群中均有發(fā)現(xiàn)，頻率如表1和表2所示。其中I1532檢測出頻率較少，且僅有野生型純合子I/I和突變型純合子T/T兩種基因型，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,突變型等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。F1534 S在所有5個蚊蟲種群中廣泛存在，其中最高的SD地區(qū)頻率高達(dá)82.8%,同時所有種群的蚊蟲均存在3種基因型，包括野生型純合子F/F,突變型純合子S/S以及雜合子F/S，雜合子的比例在ZR和DX地區(qū)中相對較高。其余3個地區(qū)蚊蟲突變純合子比例較高，同時SD地區(qū)蚊蟲的突變型等位基因頻率高于DX地區(qū)(P=0.027)和ZR(P=0.023)地區(qū)，這也可能是造成SD地區(qū)對于菊酯類殺蟲劑高度抗性的原因之一。

表1 上海市普陀區(qū)5個地區(qū)白紋伊蚊 I1532位點(diǎn)突變情況Tab.1 Mutations frequency at codon I1532 in Aedes albopictus populations from Putuo District, Shanghai

表2 上海市普陀區(qū)5個地區(qū)白紋伊蚊 F1534位點(diǎn)突變情況Tab.2 Mutations frequency at codon F1534 in Aedes albopictus populations from Putuo District, Shanghai

3 討論

在登革熱疫情處置中，化學(xué)控制依舊是重要手段。歷年監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示普陀區(qū)的蚊蟲已經(jīng)對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性(劉洪霞等，2020)，但在2015年之前抗性監(jiān)測的目標(biāo)為淡色庫蚊，由于淡色庫蚊與白紋伊蚊在抗性機(jī)制上有一定差別(Somboonetal., 2003; Pocquetetal., 2014; Liuetal., 2015)，例如，淡色庫蚊kdr基因上的有義突變位點(diǎn)較白紋伊蚊更多，酶活性的均值與白紋伊蚊有較大差異，新時期的抗性水平難以與舊時期的進(jìn)行比較。與此同時白紋伊蚊幼蟲的抗性并不能直接等同于成蟲的抗性，一項(xiàng)古巴的研究發(fā)現(xiàn)(Bissetetal., 2014)，成蟲與幼蟲在雙硫磷、殘殺威等藥物的抗性水平上有著明確差異，因此成蟲的抗藥性更能有效指導(dǎo)實(shí)際病媒控制工作。

除DX外所有地區(qū)均存在不同水平的菊酯類抗性，這意味著長期用藥已使普陀區(qū)大部分白紋伊蚊種群對菊酯類藥物產(chǎn)生抗性，這些蚊蟲種群中F1534位點(diǎn)普遍發(fā)現(xiàn)的高頻率抗性突變也證實(shí)了這一點(diǎn)，這提示了普陀區(qū)白紋伊蚊對于菊酯類廣泛地抗性已經(jīng)通過遺傳固定下來，并有通過交通等多種方式擴(kuò)散至非抗性地區(qū)的風(fēng)險。對殘殺威的抗藥性，僅在SD地區(qū)的存在，這可能與該類殺蟲劑的應(yīng)用背景有關(guān)。對于普陀居民區(qū)的化學(xué)處置主要使用菊酯類藥物而極少使用含有殘殺威的殺蟲劑，因而，大部分居民區(qū)的蚊蟲種群對殘殺威并不敏感，但是含有殘殺威的復(fù)配殺蟲劑會廣泛地應(yīng)用于蜚蠊、蠅類的滅殺，因此這類殺蟲劑常使用于農(nóng)貿(mào)集市、火車站、公共綠地等公共場所的滯留噴灑當(dāng)中，SD地區(qū)與華東師范大學(xué)中北校區(qū)相鄰，校區(qū)內(nèi)有大片公共綠地，因此SD地區(qū)較高的殘殺威抗性，可能與該地區(qū)的用藥種類及頻次有關(guān)。本研究蚊蟲采集地區(qū)由于僅包含居民區(qū)，非居民區(qū)的白紋伊蚊對于殘殺威的抗藥性還有待評價。

影響蚊蟲抗性的主要機(jī)制包括靶點(diǎn)的改變、酶活性的變化、表皮穿透性改變和行為因素，酶活性同樣也是導(dǎo)致普陀區(qū)不同地區(qū)蚊蟲種群抗性差異的重要因素。其中NSE已被發(fā)現(xiàn)與有機(jī)磷類殺蟲劑的抗性相關(guān)(Floresetal., 2006)，MFOs則主要被認(rèn)為與菊酯類殺蟲劑抗性的產(chǎn)生有關(guān)(Amelia-Yapetal., 2019)，但是這兩類解毒酶由于其廣譜解毒效果，偶爾也被發(fā)現(xiàn)與其他殺蟲劑的抗性存在一定聯(lián)系(Limaetal., 2011)，殘殺威抗性通常認(rèn)為與乙酰膽堿酯酶(AchE)間有重要聯(lián)系(Bissetetal., 2006)。本研究中，DX地區(qū)白紋伊蚊種群的NSE與MFOs酶活性均最低，這也與其較低的抗性水平相匹配。SD地區(qū)MFOs酶活性水平最高，也有著同樣最高的菊酯類殺蟲劑抗性水平，同時SD地區(qū)的F1534位點(diǎn)的突變型頻率也顯著高于對照組，因此，其對菊酯類殺蟲劑的抗性水平高于其他地區(qū)。F1534 S的表型在許多研究中被認(rèn)為會引起I型擬除蟲菊酯抗性而對II型擬除蟲菊酯影響較小(Yanetal., 2020)，這意味著SD地區(qū)對于高效氯氰菊酯的抗性可能更多地由MFOs的高活性引起。SD地區(qū)的NSE水平僅高于DX地區(qū)，可以推測SD地區(qū)白紋伊蚊的有機(jī)磷類殺蟲劑的抗性水平較低，由于該地區(qū)同時對殘殺威和菊酯類殺蟲劑高度抗性，在后續(xù)的疫情處置中有機(jī)磷類和Ⅰ型除蟲菊酯類殺蟲劑將是更好的選擇。另一個角度來說，由于NSE酶活性普遍高于DX地區(qū)，而對應(yīng)的菊酯類抗性水平與之類似，可以推測NSE酶活性也在有某些情況下可能會有限地影響蚊蟲菊酯類殺蟲劑的抗性。ZR地區(qū)的白紋伊蚊種群MFOs酶活性是唯一沒有高于對照組的地區(qū)，然而其對菊酯類的抗性在所有地區(qū)中卻僅次于SD地區(qū)，同時，kdr基因在F1534位點(diǎn)的突變水平也與其他地區(qū)無顯著差異，這提示其他因素也可能引起菊酯類抗性。例如在一些研究中(Gaoetal. 2018)，I1532位點(diǎn)的突變與菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)，而ZR地區(qū)該位點(diǎn)的突變頻率略高于其他地區(qū)。CF地區(qū)和XH地區(qū)的酶活性與抗性水平均處于中游，對Ⅱ型除蟲菊酯高效氯氰菊酯具有確定抗性，而對Ⅰ型除蟲菊酯—氯菊酯僅存在可疑抗性，因此，在殺蟲劑的選擇上可以考慮Ⅰ型除蟲菊酯或其復(fù)配劑，包括高氯殘殺威，烯丙菊酯，胺氯菊酯等。但是由于Ⅰ、Ⅱ型除蟲菊酯均會引起MFOs活性的升高，即存在一定的交叉抗性，用藥時亦需同時對這兩類殺蟲劑進(jìn)行抗性監(jiān)測。