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    葫蘆素B抑制CIP2A/AKT表達抗非小細胞肺癌的作用

    2021-02-17 12:48:10王菊輝丘韶校徐羽中李元廣
    實用癌癥雜志 2021年12期
    關(guān)鍵詞:懸液葫蘆細胞周期

    王菊輝 丘韶校 徐羽中 李元廣 何 臣

    肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因,其最常見的病理類型非小細胞肺癌(NSCLC),占所有病例的83%[1]。近年來肺癌治療取得了長足的發(fā)展,但肺癌死亡率仍居高不下,肺癌的整體治療效果仍較差,非小細胞肺癌5年相對存活率僅為23%[2]。探討新的肺癌治療藥物及其作用機制已成為肺癌治療的突破點。PP2A的內(nèi)源性癌性抑制劑CIP2A是一種人類癌蛋白,在多種人類惡性腫瘤的增殖和侵襲中起重要作用[3],研究表明,CIP2A可促進不依賴貼壁的細胞生長和體內(nèi)腫瘤形成,并在結(jié)腸及頭頸部惡性腫瘤中過表達[4]。且其過表達與腫瘤侵襲,轉(zhuǎn)移和患者生存相關(guān)[5]。在肺癌標(biāo)本中及人肺癌細胞株中也被證明存在CIP2A的過表達,并且CIP2A的過表達與肺癌患者預(yù)后相關(guān)[6]。CIP2A 抑制抑癌蛋白PP2A的表達使AKT的磷酸化(pAkt)下降,從而促進了腫瘤的增殖和進展[7]。在骨肉瘤細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞的研究中被證實[8]。在阿曼托雙黃酮及氯硝柳胺作為CIP2A的癌性抑制劑的實驗中發(fā)現(xiàn)其可促進非小細胞肺癌細胞凋亡[9,10],從而發(fā)揮抗癌作用。葫蘆素B ( Cucurbitacin B )是葫蘆素家族中含量最豐富的成員,其抗腫瘤作用是近年來的研究重點,既往的多項研究顯示葫蘆素B可能通過抑制多種細胞信號傳導(dǎo)通路來抑制腫瘤生長和促進腫瘤細胞凋亡[11],但其在不同腫瘤細胞中機制并不完全相同。在多柔比星耐藥乳腺癌細胞[12]、耐藥胃癌細胞[13]、多形性膠質(zhì)母細胞瘤[14]中發(fā)現(xiàn)葫蘆素B通過抑制CIP2A下調(diào)pAkt的表達,加速了腫瘤細胞的凋亡。綜上,葫蘆素B在多種腫瘤細胞中通過抑制CIP2A下調(diào)癌癥相關(guān)信號通路AKT的表達,促進腫瘤細胞凋亡,但葫蘆素B在非小細胞肺癌中是否存在相同機制尚需進一步研究,在本研究中我們探討了葫蘆素B通過CIP2A/AKT對非小細胞肺癌A549細胞的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    非小細胞肺癌 A549 細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫;葫蘆素 B、MTS、DMSO購自美國Sigma公司;胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司;PP2A 酶活性檢測試劑盒購自 Upstate 公司;抗體購自美國Cell Signaling公司;二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Hera-eus公司;超凈臺購自蘇州凈化設(shè)備廠;細胞計數(shù)板上海醫(yī)用儀器公司;臺式高速離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠;酶標(biāo)儀購自芬蘭Labsystem公司;垂直電泳儀購自美國Biorad公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細胞傳代培養(yǎng) 參考文獻[15]進行實驗,實驗方法簡述如下:用培養(yǎng)液(10%胎牛血清+RPMI1640)培養(yǎng)肺腺癌A549細胞,將細胞置于溫度:37℃,濕度:飽和,CO2濃度5%的培養(yǎng)箱中。觀察細胞生長情況,當(dāng)細胞生長至80%融合時進行一次傳代,在本次實驗中選用生長良好的對數(shù)生長期細胞,實驗重復(fù)3次[15]。

    1.2.2 MTS法檢測細胞增殖 參照文獻[15]方法進行,簡述如下:將已用胰酶消化,離心后的A549細胞制成濃度為3×104個/ml的細胞懸液,以每孔100 μl在96孔培養(yǎng)板中加入細胞懸液,觀察細胞貼壁后加入不同濃度的葫蘆素B儲存液,使其終濃度分別為0、20、40、80 nmol/l,試劑對照組及細胞對照組均設(shè)置3個復(fù)孔,并在條件為37℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24、48 h后在96孔培養(yǎng)板中加入MTS溶液,每孔10 μl,孵育4 h,在酶標(biāo)儀上490 nm處檢測OD值,計算細胞存活率[存活率=1-(對照組-實驗組)/對照組]×100%。

    1.2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移 在6孔板上平鋪細胞密度為5×105個/ml的A549細胞,每孔500 μl,同時加入含RPMI 1640培養(yǎng)液,其中含10%胎牛血清,在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h,觀察是否形成單層細胞。用marker筆在細胞呈單層生長的6孔板背后,用直尺均勻劃間隔約0.5 cm的橫線,直線橫穿過孔,用PBS清洗3次,隨后分別加入終濃度為0、20、40、80 nmol/l葫蘆素B,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件同上,在0 h、24 h、48 h拍照取樣。取樣后圖片用Image J軟件處理,隨機在細胞邊緣劃取6條直線,計算兩直線間距離,計算均值后代表細胞遷移距離。

    1.2.4 PI染色法檢測細胞周期 參照文獻[15],取胰酶消化,離心后的A549細胞,以濃度為5×105個/ml制成細胞懸液,在6孔板中接種細胞懸液,2 ml/孔,在同上所述相同條件下培養(yǎng)24 h;更換培養(yǎng)基,加入終濃度為0、20、40、80 nmol/l及DMSO對照的葫蘆素B,繼續(xù)在相同條件分別培養(yǎng)2 h、48 h。將以上所得細胞制成細胞懸液,細胞濃度為5×105個/ml,取細胞懸液1 ml離心(2000 rpm),棄去上清液后加入1 ml PBS液,繼續(xù)2000 rpm離心2次,每次2 min,棄去上清,加入-20 ℃70%乙醇3 ml,混勻后,4℃固定過夜,2000 rpm離心2 min,棄去上清,加入1 ml PBS液重懸細胞;再次2000 rpm離心2 min,棄上清,加入濃度為100 mg/ml的PI染液500 μl,其中含50 μg/ml RNA酶;經(jīng)30 min避光染色后上機用流式細胞儀檢測,所得結(jié)果用Multicycle軟件進行分析。

    1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 參照文獻[15],用不含EDTA的胰酶消化細胞后,1500 rpm,離心3 min,去除上清液后,用PBS液洗滌1遍,用PBS重懸細胞離心細胞,取含5×105個細胞的細胞懸液,離心后棄去上清后加入Binding buffer 500 μl重懸細胞,加入5 μl Annexin V-APC,混勻細胞后,加入7-AAD染液5 μl,再次混勻,在室溫避光環(huán)境下反應(yīng)10 min,置于冰上1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

    1.2.6 Westem blot法檢測CIP2A、P-AKT、AKT表達 取已消化離心處于對數(shù)生長期的A549細胞,配成細胞濃度為5×105個/ml的細胞懸液,在10 cm培養(yǎng)基上接種細胞懸液10 ml,觀察細胞生長至80%時,換用含40 nmol/l、80 nmol/l葫蘆素B及DMSO對照的完全培養(yǎng)基培養(yǎng),分成24 h組、48 h組,收集經(jīng)上訴處理后的細胞,加入PIRA裂解液裂解冰浴,每分鐘12000 r,4℃環(huán)境下離心10 min,取離心后上清液,BCA法測定蛋白濃度,加入同體積的SDS,混合震蕩均勻,在99 ℃環(huán)境下煮5 min,使蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜后5%牛奶封閉,一抗在4 ℃下孵育過夜,HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記后的二抗在室溫下2 h孵育,ECL發(fā)光盒顯影檢測。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 葫蘆素B對A549細胞增殖的抑制作用

    根據(jù)MTS結(jié)果可知,濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24 h及48 h后均對細胞的增殖存在抑制作用,且細胞存活數(shù)與藥物濃度及作用時間呈負相關(guān)。經(jīng)ANOVA方差后,P<0.05。用LSD-t檢驗后示不同試劑及不同時間分組與對照組間均存在有顯著性意義(P<0.05),且在80 nmol/l、48 h組時存活率達最低,為54.8%(其中P<0.0001),綜上提示葫蘆素B以劑量、時間依賴性抑制A549細胞的增殖(表1)。

    表1 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后細胞存活率檢測

    2.2 葫蘆素B對A549細胞遷移的抑制作用

    濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24h及48h后與對照組相比對細胞的遷移能力存在抑制作用,且細胞遷移距離與藥物濃度及作用時間一定程度上呈負相關(guān),且在48 h 80 nmol/l時達到最小遷移距離,此結(jié)果提示葫蘆素B以劑量及時間依賴性抑制A549細胞遷移,見圖1。

    圖1 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后的遷移距離

    2.3 葫蘆素B對A549細胞周期分布的影響

    濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24h及48h后經(jīng)流式檢測:隨著濃度梯度的增大及作用時間的延長,處于G2/M期細胞的比例逐漸增加,顯示葫蘆素B導(dǎo)致A549細胞G2/M期阻滯,且與作用濃度及時間呈正相關(guān),見圖2。

    圖2 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后細胞周期分布

    2.4 流式細胞儀檢測葫蘆素B對A549細胞凋亡的影響

    濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24 h及48 h后經(jīng)流式檢測顯示葫蘆素B促進細胞的凋亡,且葫蘆素B的濃度及作用時間與細胞凋亡呈正相關(guān),在48 h,濃度為80 nmol/l時達到最大細胞凋亡率32.1%,與對照組相比具有顯著差異,見圖3。

    圖3 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后細胞凋亡影響

    2.5 葫蘆素B作用于A549細胞后對CIP2A、PAKT、AKT蛋白表達的影響

    Western blot檢測葫蘆素B在40 nmol/l濃度下,作用A549細胞24 h及48 h后對CIP2A、PAKT、AKT表達的影響,結(jié)果顯示與對照組相比,CIP2A、PAKT表達顯著下降,且隨著作用時間的延長,CIP2A、PAKT的表達隨之下降。表明葫蘆素B可抑制CIP2A的表達,從而抑制AKT的活化,且呈現(xiàn)時間依賴性,見圖4。

    圖4 Western Blot檢測40 nmol/l葫蘆素B作用A549細胞不同時間后對蛋白表達的影響

    3 討論

    近年來,隨著中醫(yī)藥的發(fā)展,越來越多的中藥成分用于臨床治療及輔助化療中[11]。葫蘆素B作為腫瘤藥物的研究顯示:葫蘆素B對多種類型的腫瘤細胞具有明顯的抑制作用,且在不同腫瘤細胞中其作用機制并不完全相同[16]。研究發(fā)現(xiàn),葫蘆素B對結(jié)腸癌、乳腺癌等實體腫瘤,及白血病等血液系統(tǒng)腫瘤均有抗腫瘤的效應(yīng)。葫蘆素B通過抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、誘導(dǎo)細胞凋亡及阻滯細胞周期等發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。在本研究中使用MTS法檢測不同濃度葫蘆素B處理A549細胞不同時間后,結(jié)果顯示葫蘆素B以劑量和時間依賴性抑制A549細胞增殖。且在80 nmol/l,48 h組時存活率達最低,為(54.8±2.8)%(其中P<0.0001)。細胞遷移是癌癥轉(zhuǎn)移的重要過程,劃痕試驗結(jié)果表明葫蘆素B可抑制A549細胞遷移,且在一定程度上呈劑量、時間依賴性。流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示,在不同作用時間及藥物濃度下,葫蘆素B均對A549細胞的凋亡產(chǎn)生了一定的促進作用,且細胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯,以上變化呈現(xiàn)出明顯的劑量及時間依賴性。流式檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,加入不同濃度葫蘆素B后與對照組相比細胞凋亡明顯增加,且這種增加表現(xiàn)為隨著藥物濃度梯度增加、作用時間延長,細胞凋亡率增加。表明在體外條件下葫蘆素B對非小細胞肺癌具有促進凋亡的作用。綜上表明,葫蘆素B抑制了A549細胞增殖及侵襲,使細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯,促進細胞的凋亡,從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。這與既往葫蘆素B在多種腫瘤細胞中的作用是一致的[11]。

    CIP2A作為1個新興的癌癥治療靶標(biāo),在多項研究中被證實,其通過抑制PP2A介導(dǎo)的Akt的去磷酸化來激活A(yù)kt從而促進腫瘤的發(fā)生[13]。Liang等在研究Rabdocoetsin B作為癌癥抑制劑的實驗中發(fā)現(xiàn),Rabdocoetsin B可以作用于CIP2A/AKT通路來抑制腫瘤細胞的生長[18]。在研究多形性膠質(zhì)母細胞瘤中,葫蘆素B作為抑癌劑抑制了CIP2A的表達,并且通過調(diào)節(jié)其下游的AKT信號分子使多形性膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生凋亡[14]。在本研究中,運用40nmol/l葫蘆素B分別作用A549細胞24h及48h后,western Blot結(jié)果提示A549細胞中存在CIP2A表達,且與對照組相比,葫蘆素B作用后A549細胞中CIP2A、PAKT的表達下降,且隨著作用時間延長,CIP2A、PAKT的表達下降越明顯,這與葫蘆素B通過時間依賴性抑制非小細胞肺癌細胞凋亡是同步的,提示葫蘆素B通過抑制CIP2A、PAKT的表達,抑制腫瘤細胞的增殖,促進細胞凋亡。

    綜上,我們的研究表明葫蘆素B通過抑制CIP2A/AKT信號途徑顯著抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖、遷移,阻滯細胞周期于G2/M期,促進細胞的凋亡,進而發(fā)揮其抗癌作用。

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