高效液相色譜法測(cè)定頭孢拉定膠囊有關(guān)物質(zhì)及方法學(xué)驗(yàn)證

杜瑋煒（1. 廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠，廣州 510515；2. 廣東省化學(xué)藥原料與制劑關(guān)鍵技術(shù)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510515）

頭孢拉定（cefradine，Velosef）是由百時(shí)美施貴寶公司于1972年研究成功的第一代半合成頭孢類抗菌藥物。其適應(yīng)證為用于敏感菌導(dǎo)致的各種呼吸道、泌尿生殖道及皮膚軟組織感染等。除注射劑外，頭孢拉定可制成多種口服制劑，包括頭孢拉定干混懸劑、頭孢拉定片、頭孢拉定膠囊和頭孢拉定顆粒。

頭孢拉定原料有關(guān)物質(zhì)HPLC 檢查方法收載于《中國(guó)藥典》2020年版[1]，其有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)方法的色譜條件與含量測(cè)定方法（同時(shí)測(cè)定頭孢氨芐含量）相同，以水-甲醇-3.86%醋酸鈉溶液-4%醋酸溶液（1564∶400∶30∶6）為流動(dòng)相等度洗脫各雜質(zhì)。2020年版《中國(guó)藥典》中頭孢拉定的各種制劑產(chǎn)品要么沒有設(shè)置有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)（頭孢拉定干混懸劑和頭孢拉定顆粒），要么采用和原料相同的色譜條件進(jìn)行雜質(zhì)檢驗(yàn)（頭孢拉定膠囊、頭孢拉定片和注射用頭孢拉定）。然而《中國(guó)藥典》方法具有一定的局限性：對(duì)弱保留的雜質(zhì)分離效果較差[2-3]。起始原料7-ADCA 峰和二氫苯甘氨酸（雜質(zhì)B）峰與溶劑峰保留時(shí)間相近（見圖1 和圖2）；其他主要降解雜質(zhì)雜質(zhì)C、D、E 均在3 ～5 min 內(nèi)出峰（見圖3）。并且按照《中國(guó)藥典》方法，除頭孢氨芐峰和頭孢拉定主峰外，起始原料7-ADCA 作為已知雜質(zhì)按照外標(biāo)法定量，而最大的另一個(gè)工藝雜質(zhì)——4'，5'-二氫頭孢拉定峰被認(rèn)為是其他單雜，在頭孢拉定膠囊中按照2.5%的限度控制，其他重要的能夠體現(xiàn)制劑產(chǎn)品質(zhì)量的降解產(chǎn)物（雜質(zhì)C、D、E）反而不能得到有效的控制。

圖1 《中國(guó)藥典》有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法溶劑色譜圖Fig 1 Chromatogram of solvent by ChP method

圖2 《中國(guó)藥典》方法雜質(zhì)混合對(duì)照品溶液色譜圖Fig 2 Chromatogram of mixed impurity standards by ChP method

圖3 《中國(guó)藥典》方法供試品溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of sample by ChP method

為解決上述問題，本研究參考英國(guó)藥典[4]對(duì)方法進(jìn)行了研究和改進(jìn)，建立了方便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)及靈敏度高的頭孢拉定膠囊有關(guān)物質(zhì)HPLC 測(cè)定法并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

安捷倫1260 高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器，Agilent 公司），戴安U-3000 高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器，Thermo Fisher 公司），CPA225D十萬分之一電子天平（Sartorius 公司）。頭孢拉定膠囊（施貴寶、英國(guó)KENT），頭孢拉定（批號(hào)：130427-201107，純度：88.3%）、雜質(zhì)A（7-ADCA，批號(hào)：130416-201006，純度：98.5%）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院），雜質(zhì)B（二氫苯甘氨酸，EP，批號(hào)：3.0，純度：100%）；雜質(zhì)C（批號(hào)：PILD0701-C01，純度：96.84%）、雜質(zhì)D（批號(hào)：PILD0607-D01，純度：96.84%）、4'，5'-二氫頭孢拉定（批號(hào)：PILD1226-EQ01，純度：98.75%）（對(duì)照品，廣州牌牌生物科技有限公司）；雜質(zhì)E（深圳卓越生物科技有限公司，批號(hào)：PILD0419-E08，純度：98.24%）；雜質(zhì)F（批號(hào)：1534-079A3，純度：100%）、雜質(zhì)G（批號(hào)：2144-023A2，純度：99.8%）（美國(guó)TLC），甲醇（色譜純，美國(guó)Merck公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：費(fèi)羅門Luna 5u C18（2）100A（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL；流動(dòng)相：以2.72 g·L－1磷酸二氫鉀溶液（用稀磷酸調(diào)pH 至3.0）為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，按表1 進(jìn)行線性梯度洗脫；流速：1.0 mL·min－1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program of mobile phase

2.2 系統(tǒng)適用性

取頭孢拉定對(duì)照品和頭孢氨芐對(duì)照品適量，用流動(dòng)相A 溶解并稀釋制成每1 mL 中約各含0.12 mg 的溶液，取25 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，頭孢氨芐峰與頭孢拉定峰間的分離度為6.7（不得低于4.0），符合系統(tǒng)適用性要求，見圖4。

圖4 系統(tǒng)適用性色譜圖（220 nm）Fig 4 Chromatogram of system suitability（220 nm）

2.3 供試品溶液的配制

取頭孢拉定膠囊內(nèi)容物，精密稱取適量，加流動(dòng)相A 溶解并定量稀釋制成每1 mL 中含6 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 對(duì)照溶液的配制

精密量取供試品溶液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液（1%自身對(duì)照）。

2.5 測(cè)定法

分別精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各25 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。相對(duì)保留時(shí)間（以下簡(jiǎn)稱RRT）為0.52 的峰為雜質(zhì)C；RRT為0.62 的峰為雜質(zhì)D；RRT 為0.80 的峰為雜質(zhì)E；RRT 為1.06 的峰為4'，5'-二氫頭孢拉定。雜質(zhì)C、D、E 及4'，5'-二氫頭孢拉定按自身對(duì)照法計(jì)算含量。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專屬性

3.1.1 強(qiáng)制破壞試驗(yàn) 空白溶劑及各輔料對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定不會(huì)造成干擾。樣品在酸、堿、氧化、光照、高溫等條件下破壞得到的雜質(zhì)峰均與頭孢拉定峰的分離度符合要求（不低于1.5），降解產(chǎn)物峰之間也具有良好的分離度，各破壞條件下主峰純度因子均大于990。通過比較試驗(yàn)前后總峰面積的變化，物料平衡（A破壞后總峰面積/A破壞前總峰面積×100%）在90%～110%，方法專屬性符合要求，結(jié)果詳見表2。

表2 強(qiáng)制破壞性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Tab 2 Determination of forced degradation test

3.1.2 雜質(zhì)對(duì)照品外加法 取雜質(zhì)A、B、C、D、E、4'，5'-二氫頭孢拉定、雜質(zhì)F 及雜質(zhì)G 適量，分別溶解于流動(dòng)相A 后加至供試品溶液中，精密量取25 μL，注入液相色譜儀，已知雜質(zhì)無干擾（見圖5）。

圖5 雜質(zhì)混合對(duì)照品外加溶液色譜圖（220 nm 波長(zhǎng)）Fig 5 Chromatogram of mixed impurity standards added in sample solution（220 nm）

3.2 線性關(guān)系及檢測(cè)限和定量限

通過配制6 份系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)本方法的線性和范圍進(jìn)行驗(yàn)證。以各雜質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。將雜質(zhì)對(duì)照品溶液稀釋至相應(yīng)的濃度，根據(jù)信噪比10∶1，計(jì)算得各雜質(zhì)的定量限；信噪比3∶1，計(jì)算得各雜質(zhì)的檢測(cè)限。結(jié)果表明雜質(zhì)A ～G、4'，5'-二氫頭孢拉定及頭孢拉定在相應(yīng)范圍內(nèi)線性符合要求，方法靈敏度符合要求。

表3 雜質(zhì)線性方程、檢測(cè)限和定量限結(jié)果Tab 3 Regression equation，LOD and LOQ of impurities

3.3 準(zhǔn)確度、精密度及耐用性試驗(yàn)

通過雜質(zhì)對(duì)照品加樣回收試驗(yàn)計(jì)算方法準(zhǔn)確度；結(jié)合重復(fù)性和中間精密度判斷方法精密度；改變柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相pH 對(duì)方法耐用性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表4 ～5，表明該方法適用于頭孢拉定膠囊有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

表4 驗(yàn)證項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果Tab 4 Determination of validation

表5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Durability test

3.4 樣品測(cè)定

取國(guó)內(nèi)外上市頭孢拉定膠囊樣品5 批，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表6。在5 批頭孢拉定膠囊制劑中均未檢出雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)F 和雜質(zhì)G，除去工藝雜質(zhì)4'，5'-二氫頭孢拉定外，最大單雜均為雜質(zhì)E。國(guó)內(nèi)地產(chǎn)化原研產(chǎn)品（施貴寶）的有關(guān)物質(zhì)略好于國(guó)外上市（英國(guó)KENT）的同品種制劑。

表6 頭孢拉定膠囊有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果(%)Tab 6 Determination of related substances in samples (%)

4 討論

《中國(guó)藥典》采用外標(biāo)法控制雜質(zhì)A（7-ADCA）不得過1.0%，而雜質(zhì)A（7-ADCA）在國(guó)內(nèi)上市的390 批次頭孢拉定膠囊[2]和國(guó)內(nèi)外上市制劑（施貴寶、英國(guó)KENT）以及強(qiáng)制破壞樣品中均未檢出。較為復(fù)雜的外標(biāo)法操作顯得必要性不強(qiáng)，并且藥典對(duì)雜質(zhì)A（7-ADCA）規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)過高，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕档汀?/p>

4'，5'-二氫頭孢拉定是頭孢拉定合成的工藝產(chǎn)物（還原產(chǎn)物），其含量穩(wěn)定，不會(huì)隨著穩(wěn)定性留樣過程而增加。英國(guó)藥典中4'，5'-二氫頭孢拉定用含量測(cè)定方法測(cè)定（檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm），限度定為2.0%（外加校正因子1.6），并將4'，5'-二氫頭孢拉定、頭孢氨芐和頭孢拉定一起作為活性成分計(jì)入含量。雖然《中國(guó)藥典》的色譜條件和英國(guó)藥典不同，但有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)也是254 nm，從理論上判斷，兩種方法中4'，5'-二氫頭孢拉定的校正因子應(yīng)相當(dāng)，《中國(guó)藥典》中有關(guān)物質(zhì)單個(gè)雜質(zhì)2.5%的限度算上校正因子其實(shí)為4.0%，顯著高于英國(guó)藥典的這一限度。在全國(guó)范圍內(nèi)選擇9 個(gè)代表性頭孢拉定制劑生產(chǎn)地區(qū)，從中隨機(jī)抽取20 批頭孢拉定膠囊（每個(gè)地區(qū)1 ～4批），有關(guān)物質(zhì)最大單雜為1.2%～1.7%[5]，顯著小于《中國(guó)藥典》中有關(guān)物質(zhì)單個(gè)雜質(zhì)2.5%的限度要求，進(jìn)一步說明藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)過高。而本研究提供的方法，用220 nm 檢測(cè)4'，5'-二氫頭孢拉定，校正因子經(jīng)計(jì)算在0.9 ～1.1（1.03），適合用自身對(duì)照法定量。

除頭孢菌素外（頭孢拉定、頭孢氨芐、4'，5'-二氫頭孢拉定），雜質(zhì)C、雜質(zhì)D 和雜質(zhì)E 的含量較大（其降解見圖6 ～7），且隨穩(wěn)定性放樣時(shí)間的延長(zhǎng)及穩(wěn)定性放樣溫度的升高而增長(zhǎng)，其含量可反映頭孢拉定降解水平，有必要對(duì)其進(jìn)行限量規(guī)定。

圖6 雜質(zhì)C、D 降解機(jī)制圖Fig 6 Degradation mechanisms of impurity C and impurity D

圖7 雜質(zhì)E 降解機(jī)制圖Fig 7 Degradation mechanisms of impurity E

綜上所述，《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)中頭孢拉定有關(guān)物質(zhì)方法雜質(zhì)分離效果不佳，單雜限度過高，且對(duì)反映頭孢拉定膠囊降解水平的雜質(zhì)C、雜質(zhì)D和雜質(zhì)E 無法控制。本研究建立的頭孢拉定膠囊有關(guān)物質(zhì)分析方法，能更有效的分離出各雜質(zhì)，且簡(jiǎn)單、靈敏，專屬性高，適用于頭孢拉定膠囊有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。