阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)大鼠缺鐵性貧血的改善及其對(duì)鐵代謝的調(diào)節(jié)作用機(jī)制初探

恰木斯亞·吐?tīng)栠d哈里，美拉依·吉恩斯，武嘉林，2*（. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 8300；2.新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司，烏魯木齊 8300）

貧血影響著全球大約30%的人們的健康，其中有50%是由缺鐵引起的[1]。缺鐵性貧血（IDA）是由于鐵攝入不足、吸收不良、轉(zhuǎn)運(yùn)受損、利用障礙等原因引起的機(jī)體鐵缺乏，導(dǎo)致人體血液中紅細(xì)胞生成減少而引起的貧血，在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)的嬰幼兒、育齡婦女中多發(fā)[2]。口服鐵劑是最常見(jiàn)的治療缺鐵性貧血的手段，但近幾年報(bào)道口服鐵劑不良反應(yīng)較多，例如水溶性差、生物利用率低，導(dǎo)致過(guò)量的游離鐵進(jìn)入體內(nèi)，刺激胃腸道引起惡心、嘔吐、腹部不適等，且過(guò)量補(bǔ)鐵造成鐵超載的同時(shí)會(huì)引發(fā)肝臟、心血管的損傷和神經(jīng)退行性病變[3]。因此近年來(lái)毒副作用較低、作用溫和、多成分的中藥補(bǔ)鐵劑在臨床應(yīng)用中凸顯其優(yōu)勢(shì)。

阿膠強(qiáng)骨口服液是由熟地、阿膠、黃芪等中藥組成，依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論，具有補(bǔ)益肝腎、填精壯骨、生血扶正等功效。前期研究[4-6]發(fā)現(xiàn)其對(duì)貧血有一定療效，以往研究多集中在阿膠強(qiáng)骨口服液的含量測(cè)定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究等方面，未見(jiàn)其對(duì)缺鐵性貧血及鐵代謝影響的研究。本實(shí)驗(yàn)擬研究阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)大鼠缺血性貧血的改善作用并初步探討其對(duì)鐵代謝的調(diào)節(jié)作用，為阿膠強(qiáng)骨口服液應(yīng)用于臨床治療缺鐵性貧血提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

阿膠強(qiáng)骨口服液（新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：10 mL/支，批號(hào)：2019111802）；硫酸亞鐵（山西力玖藥業(yè)有限公司，批號(hào)：180319）；復(fù)方阿膠漿（山東東阿阿膠股份有限公司，批號(hào)：1806027）；低鐵飼料（睿迪生物科技深圳有限公司，批號(hào)：18073112，含鐵量6.7 mg·kg－1）；膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FPN-1）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：20200517）；二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DMT-1）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：20210518）。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量180 ～200 g [新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002]，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障環(huán)境，維持室溫在（24±2）℃，濕度 50%～60%，采用12 h 晝夜節(jié)律 7：00 ～19：00 飼養(yǎng)。

1.3 儀器

分析天平（FA104，上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；ABM 型小動(dòng)物麻醉機(jī)（異氟醚，上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀（750型，日本光學(xué)株式會(huì)社）；酶標(biāo)儀（Model 680，美國(guó)伯樂(lè)公司）；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（5417R，德國(guó)EPPENDORF 公司）。

2 方法

2.1 IDA 大鼠模型的建立

60 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（8 只）和造模組（52 只）。根據(jù)文獻(xiàn)[7]方法加以改進(jìn)，模型組飼喂低鐵飼料、飲用去離子水，每隔3 d 耳緣靜脈放血1 mL。依據(jù)查閱的相關(guān)研究及臨床鑒定標(biāo)準(zhǔn)，血紅蛋白（HGB）＜90 g·L－1，符合輕度缺鐵性貧血判斷標(biāo)準(zhǔn)，表明造模成功。正常對(duì)照組投喂正常飼料并給予自來(lái)水，每周稱重并記錄體質(zhì)量。造模28 d 后采血進(jìn)行分析，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠HGB。

2.2 分組與給藥

2.2.1 動(dòng)物分組 造模過(guò)程中死亡4 只，造模成功的模型大鼠隨機(jī)分為6 組：模型對(duì)照組，硫酸亞鐵組（陽(yáng)性藥物組），復(fù)方阿膠漿組，低、中、高劑量阿膠強(qiáng)骨組，每組8 只。

2.2.2 給藥

① 硫酸亞鐵組：灌胃硫酸亞鐵混懸液5 mL·kg－1及去離子水10 mL·kg－1（臨床用量：成人每日3 片，規(guī)格：含鐵60 mg/片，按動(dòng)物與人體質(zhì)量比折算，以成人60 kg 計(jì)，大鼠的等效劑量為5 mL·kg－1）。

② 復(fù)方阿膠漿組：6.3 mL·kg－1灌胃給藥（臨床用量：每日20 mL/支，按動(dòng)物與人體體質(zhì)量比折算，以成人60 kg 計(jì)，大鼠的等效劑量為6.3 mL·kg－1）。

③ 阿膠強(qiáng)骨口服液組：低、中、高劑量分別為3.15、6.3、12.6 mL·kg－1灌胃給藥（臨床用量：每支10 mL，每日3 支；按動(dòng)物與人體體質(zhì)量比計(jì)算，以成人60 kg 計(jì)，大鼠的等效劑量為3.15 mL·kg－1設(shè)為低劑量，中劑量為2 倍即6.3 mL·kg－1，高劑量為4 倍即12.6 mL·kg－1）。

造模完成后，各給藥組均連續(xù)灌胃28 d，每隔3 d 稱體質(zhì)量，并拍照觀察狀態(tài)。灌胃給藥期間各藥物組、模型對(duì)照組飼喂低鐵飼料，防止外源性鐵的攝入，正常對(duì)照組則給予正常飼料。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 大鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)測(cè)定 各組動(dòng)物末次給藥后，禁食12h，稱重記錄末次體質(zhì)量。完成取血后，脫頸椎處死大鼠，并解剖剝離心臟、肝臟、脾臟，并稱量各臟器質(zhì)量。臟器系數(shù)即為各臟器質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。

2.3.2 血常規(guī)檢測(cè) 造模28 d 后所有大鼠眼眶取血置含抗凝劑 EDTA-2K 的EP 管中，用于血常規(guī)分析。各組動(dòng)物末次給藥后，禁食12 h。大鼠麻醉后頸動(dòng)脈取血1 mL 置含抗凝劑 EDTA-2K 的EP管中，用于血常規(guī)分析。

2.3.3 血生化檢測(cè) 采集的血液放置在37 ℃培養(yǎng)箱1 h，冰箱4℃過(guò)夜，3000 r·min－1離心20 min，吸取上清液，測(cè)定血清鐵（SI）。

2.3.4 鐵代謝相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)大鼠DMT-1、FPN-1。取各組大鼠十二指腸同一部位，切割標(biāo)本后，稱取質(zhì)量。加入一定量的PBS 后用手動(dòng)勻漿器勻漿，充分離心后收集上清液。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出各給藥組蛋白含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較用SNK 法；多組不符合正態(tài)性比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)缺鐵性貧血大鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響

大鼠體質(zhì)量及各臟器指數(shù)如表1 所示，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量較正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），各藥物組補(bǔ)鐵后大鼠體質(zhì)量回升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟是最重要的儲(chǔ)鐵器官之一，而鐵主要以鐵蛋白和含鐵血黃素形式存在于此[8]。與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)鐵后各組大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和心臟指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)缺鐵性貧血大鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on body mass and organ index in rats with iron deficiency anemia ( ±s，n ＝8)

表1 阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)缺鐵性貧血大鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響( ±s，n ＝8)Tab 1 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on body mass and organ index in rats with iron deficiency anemia ( ±s，n ＝8)

注（Note）：與正常對(duì)照組比較，##P ＜0.01（Compared with the normal control group，##P ＜0.01）。

組別體質(zhì)量/g肝臟指數(shù)/%脾臟指數(shù)/%心臟指數(shù)/%正常對(duì)照組416.00±25.072.67±0.080.19±0.040.33±0.04模型對(duì)照組394.70±61.58##2.40±0.230.20±0.040.35±0.06硫酸亞鐵組395.20±43.202.26±0.420.23±0.070.32±0.03復(fù)方阿膠漿組385.60±43.202.21±0.210.23±0.040.32±0.04阿膠強(qiáng)骨口服液低劑量組408.90±30.572.33±0.310.24±0.050.36±0.05阿膠強(qiáng)骨口服液中劑量組407.30±46.282.42±0.270.25±0.060.32±0.04阿膠強(qiáng)骨口服液高劑量組409.90±43.862.37±0.340.24±0.040.36±0.05

3.2 阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)大鼠血常規(guī)的影響

造模28 d 后進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠HGB下降[（179.00±8.60）vs（78.29±8.60）g·L－1，P＜0.05]。依據(jù)臨床鑒定標(biāo)準(zhǔn)，HGB 低于90 g·L－1，符合輕度缺鐵性貧血模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[9-15]。且模型對(duì)照組較正常對(duì)照組紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞比容（HCT）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。

圖1 大鼠造模完成時(shí)血常規(guī)變化Fig 1 Blood routine indicators at the completion of modeling in rats

藥物干預(yù)28 d 后測(cè)試各組大鼠血常規(guī)指標(biāo)。由圖2 可知，各組HGB 值均不同程度的增加，阿膠強(qiáng)骨口服液低、中、高劑量組較模型對(duì)照組HGB（91.0±6.98）g·L－1分別增加到（127.8±7.33）、（131.0±9.67）、（131.4±8.33）g·L－1；HCT 較模型對(duì)照組（26.05±1.64）%分別增加到（32.78±1.60）%、（35.2±3.73）%、（33.5±2.02）%。HGB 減少是缺鐵性貧血的主要表現(xiàn)形式之一[16-17]。臨床上紅細(xì)胞MCH 和MCV下降多見(jiàn)于缺鐵性貧血[18]。由圖2 可知，在給藥期內(nèi)所有實(shí)驗(yàn)組大鼠的MCH 值和MCV 值均明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05）；且阿膠強(qiáng)骨口服液各劑量組均趨于正常。

圖2 阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)缺鐵性貧血大鼠血常規(guī)影響Fig 2 Effect of Ejiao Qianggu oral solution on blood routine examinationin rats with iron deficiency anemia

3.3 阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)大鼠血清鐵及DMT-1、FPN-1 蛋白的影響

SI 含量檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示，與正常對(duì)照組比較，模型組SI 含量顯著降低；與模型對(duì)照組比較，阿膠強(qiáng)骨口服液中、高劑量組SI 顯著升高（P＜0.05），提示阿膠強(qiáng)骨口服液能增加SI 含量。

圖3 阿膠強(qiáng)骨口服液對(duì)大鼠SI 及DMT-1、FPN-1 蛋白的影響Fig 3 Effect of Ejiao Qianggu oral liquid on the serum iron，DMT-1 and FPN-1 proteins in rats

大鼠十二指腸DMT-1、FPN-1 蛋白含量測(cè)定結(jié)果如圖3 所示。DMT-1 蛋白測(cè)定中阿膠強(qiáng)骨中、高劑量組較模型對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），提示阿膠強(qiáng)骨口服液顯著增強(qiáng)缺鐵性貧血大鼠十二指腸DMT-1 蛋白的表達(dá)。FPN-1 蛋白測(cè)定中阿膠強(qiáng)骨口服液高劑量組與模型對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），提示阿膠強(qiáng)骨口服液高劑量組能顯著增強(qiáng)缺鐵性貧血大鼠十二指腸FPN-1 蛋白的表達(dá)。

4 討論

4.1 阿膠強(qiáng)骨口服液藥理作用分析

HGB 又稱血色素，是紅細(xì)胞的主要組成部分，能與氧結(jié)合，運(yùn)輸氧和二氧化碳。HGB 變化的臨床意義基本和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的臨床意義相似，HGB 能更好地反映貧血的程度[19-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿膠強(qiáng)骨口服液能增加HGB 含量，且效果與陽(yáng)性藥物相當(dāng)，又能增加HCT、MCH、MCHC、MCV 含量。模型對(duì)照組紅細(xì)胞數(shù)較造模完成時(shí)略有增加，可能與貧血模型大鼠長(zhǎng)期缺氧（HGB 含量低，貧血），機(jī)體代償性增加紅細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。鐵是構(gòu)成HGB 的一種重要組成部分，為機(jī)體的必需微量元素之一，參與機(jī)體的生命活動(dòng)。鐵離子的主要轉(zhuǎn)運(yùn)形式是SI 與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合[21-23]。阿膠強(qiáng)骨口服液能增加SI 含量且與給藥劑量呈線性遞增關(guān)系。食物中的鐵離子主要經(jīng)腸上皮細(xì)胞表達(dá)的DMT-1 和FPN-1 進(jìn)入血液[24]。DMT-1 在各組織中都有分布，但是在近端小腸表達(dá)最高[25]。FPN-1 作為跨膜鐵輸出蛋白，主要在十二指腸絨毛上皮細(xì)胞的基底端和基底膜分布，將腸細(xì)胞內(nèi)的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，進(jìn)入血液[26]?；诖吮狙芯窟x擇了具有代表性的以上兩種蛋白，結(jié)果阿膠強(qiáng)骨口服液能增加大鼠十二指腸DMT-1 和FPN-1 蛋白含量，推測(cè)阿膠強(qiáng)骨口服液通過(guò)上調(diào)DMT-1 和FPN-1 來(lái)促進(jìn)十二指腸對(duì)鐵的吸收，增加SI 含量，促進(jìn)HGB 合成。

4.2 阿膠強(qiáng)骨口服液組方規(guī)律分析

阿膠強(qiáng)骨口服液由熟地、阿膠、枸杞、黃芪、黨參、牡蠣等組成，依據(jù)“氣血互生、氣升血長(zhǎng)”的傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論加味而成。

君藥熟地補(bǔ)血滋陰，益精填髓。研究表明熟地黃內(nèi)含梓醇、糖類、氨基酸、地黃苷以及多種微量元素，可增強(qiáng)人體免疫力，促進(jìn)造血。相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)研究顯示熟地黃水提物可增加實(shí)驗(yàn)鼠骨髓造血干細(xì)胞以及祖細(xì)胞的增殖分化過(guò)程，能夠加速增加HGB，加速造血功能恢復(fù)[27-28]。

臣藥阿膠補(bǔ)血滋陰，潤(rùn)燥，止血。阿膠含有多種氨基酸和微量元素，有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)造血功能、促進(jìn)骨愈合等作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿膠能夠治療貧血，且不影響鐵儲(chǔ)備[29]。阿膠中的甘氨酸成分可調(diào)節(jié)SI 以發(fā)揮加快血液合成HGB 速度，控制缺鐵性貧血[30]。相關(guān)臨床實(shí)踐研究證明中藥阿膠在刺激機(jī)體紅細(xì)胞與HGB 再生功能方面的療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鐵劑，故多被應(yīng)用于血小板減少、白細(xì)胞減少癥以及缺鐵性貧血癥[31-32]。本次實(shí)驗(yàn)研究也表明阿膠強(qiáng)強(qiáng)骨口服液能顯著增加大鼠SI 含量、HGB 含量，與臨床上眾多學(xué)者的研究結(jié)果相同[33]。

佐藥黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，生津養(yǎng)血。黨參具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之功效，用于脾肺氣虛、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短等癥，具有增強(qiáng)造血功能、調(diào)節(jié)血壓等功效，臨床上可用于防治高血脂癥、低血壓、造血功能障礙[34]。牡蠣重鎮(zhèn)安神、潛陽(yáng)補(bǔ)陰、軟堅(jiān)散結(jié)。牡蠣咸寒、斂陰止汗，黃芪性溫、補(bǔ)氣益損，兩者配伍，一補(bǔ)一澀，陰陽(yáng)兼顧，共俱補(bǔ)虛止汗之功，陰陽(yáng)氣血不足多用此兩味。臨床對(duì)于懷孕婦女及小兒鈣質(zhì)缺乏等有效[35-37]。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為熟地、阿膠、黃芪、黨參四味藥配伍具有補(bǔ)血補(bǔ)氣、補(bǔ)精填髓的功效，由此推測(cè)阿膠強(qiáng)骨口服液中補(bǔ)血生血的藥味主要是熟地、阿膠，其次是黃芪與黨參。整個(gè)組方君臣佐使分明，依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論多角度、多靶點(diǎn)治療貧血，方中各藥味協(xié)同使用可氣血雙補(bǔ)。

綜上所述，阿膠強(qiáng)骨口服液能有效改善大鼠缺鐵性貧血、促進(jìn)鐵代謝，其作用機(jī)制與腸道鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的DMT-1、FPN-1 蛋白密切相關(guān)。相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照（硫酸亞鐵補(bǔ)鐵組）并未出現(xiàn)不良反應(yīng)。阿膠強(qiáng)骨口服液中具體何種物質(zhì)治療貧血?jiǎng)t有待進(jìn)一步深入研究，本結(jié)果有望為開(kāi)發(fā)一種新的治療缺鐵性貧血的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。