柏子仁抗焦慮作用評價及機制探究

蔣征奎，寧二娟，王學方，李曉（. 鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院（河南省腫瘤醫(yī)院），鄭州 450003；. 河南省植物天然產物開發(fā)工程技術研究中心，鄭州 45000）

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和各方面壓力的增大，人群中的焦慮現(xiàn)象日益顯著并影響深遠。焦慮癥是一種以持續(xù)和廣泛焦慮情緒或反復發(fā)作的驚恐不安為主要特征的神經癥[1]，常伴有心率加快、肌肉緊張、運動性不安、自主神經紊亂和睡眠障礙等表現(xiàn)[2-3]。世界衛(wèi)生組織對包括我國在內的28 個國家的14 項流行病學研究結果表明，西方國家人群的焦慮癥終身發(fā)病率為13.6%～28.8%，其中美國高達28.7%，而我國為2%～4.7%[4]，女性的發(fā)病率高于男性。焦慮癥已對人們的正常生活造成嚴重影響[5-6]，探尋和使用合理有效的治療藥物和手段已成為全球范圍內的焦點。目前臨床常用的抗焦慮藥物主要為苯二氮?類藥物，鑒于其藥物依賴性及較大的不良反應，不建議長期使用；還有抗抑郁藥物，如5-羥色胺再攝取抑制劑類和去甲腎上腺素再攝取的抑制劑類藥物，也具有抗焦慮作用，但其胃腸道不良反應較大，臨床使用受到很大的限制。

近年來，越來越多的抗焦慮研究聚焦于傳統(tǒng)中醫(yī)藥，以期找到有效的抗焦慮癥藥物[7]。柏子仁為柏科植物側柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟種仁，性平味甘，入心、肝、腎、大腸經，具有養(yǎng)肝寧心、益智安神、斂汗?jié)櫾锏墓πВ瑥V泛應用于治療焦慮證的名方中[8-9]，現(xiàn)代藥理研究表明柏子仁具有改善睡眠、鎮(zhèn)靜益智和神經保護等作用[10-12]。目前，關于柏子仁的研究多集中在化學成分與臨床應用方面[13]，而對于其在抗焦慮方面的藥效學機制研究較少。為此，本研究考察了柏子仁醇提物的抗焦慮作用并進行相關的作用機制探討，以期為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BS-223S 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；XR-XG201 高架十字迷宮、XRXZ301 曠場箱和XR-XB120 明暗箱實驗系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）；超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國伯樂公司）。

1.2 試藥

柏子仁[河南張仲景大藥房股份有限公司，經河南大學藥學院張保國教授鑒定為柏科植物側柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟種仁]。地西泮（北京益民藥業(yè)有限公司，批號：20170906， 規(guī)格：2.5 mg/片）；γ-氨基丁酸（GABA）試劑盒（批號：20180803）、谷氨酸（Glu）ELISA 試劑盒（上海西塘生物科技有限公司，批號：20180902）；其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

SPF 級昆明種小鼠，雄性，體質量18 ～22 g [河南省實驗動物中心，許可證號SCXK（豫）2016-0002]。

2 方法

2.1 柏子仁醇提物的制備

采用溶劑超聲提取法提取柏子仁油：取柏子仁100 g 粉碎后，加4500 mL 95%乙醇，80 ℃提取55 min，濃縮，得殘留物31.4 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 造模及給藥

選取72 只小鼠，隨機分為6 組，分別為柏子仁高、中、低劑量（400、200 和100 mg·kg－1）組，陽性藥物組，模型組和空白對照組，每組12 只。

行為學實驗前，將小鼠飼養(yǎng)于晝夜循環(huán)正常的鼠籠中，控制室溫為（20±2）℃。待小鼠自由攝食飲水7 d 后，每日安撫3 min，持續(xù)3 d，以排除或減少無關刺激對實驗過程和結果的影響。實驗開始后，除空白對照組外，其余5 組小鼠均以單只單籠的形式飼養(yǎng)，并于每日隨機給予以下刺激中的1 種：斷食24 h、斷水24 h、晝夜循環(huán)顛倒24 h、夾尾3 min、束縛3 h、10 ℃冷水游泳5 min、30 V 電壓電擊足底，電擊5 s 間歇5 s，共進行300 s，持續(xù)21 d 的處理后建立焦慮模型[14]。

造模第2 周開始，每日進行應激刺激前1 h，柏子仁高、中、低劑量組分別灌胃給藥柏子仁醇提物400、200 和100 mg·kg－1，陽性藥物組灌胃給予地西泮1 mg·kg－1，模型組和空白對照組每日灌胃給予等劑量的生理鹽水，連續(xù)14 d，末次給藥30 min后進行行為學實驗（包括高架十字迷宮實驗、曠場實驗、孔板實驗和明暗箱實驗等），實驗時間段固定為每日08：00 ～15：00，在每個實驗之前使用5%乙醇清潔設備以排除可能的提示效應。在行為學實驗結束后，將動物斷頭取腦，測定海馬GABA 及Glu 的水平。受試藥物用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液一起研磨混勻后給藥，每日臨用新配。

2.3 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮由兩個開臂（300 mm×50 mm）和兩個閉臂（300 mm×50 mm）組成，實驗測試前[15]將每只小鼠放入塑料盒中，自由行走5 min后，將其放置于十字迷宮中，閉臂的周圍和尾端被150 mm 高的圍欄包圍，開臂和閉臂通過中心區(qū)域（50 mm×50 mm）連接，使用時升高至離地高度50 cm 中央平臺的中心區(qū)域，使其面向開臂并自由活動。然后，采用計算機實時跟蹤小鼠在高架上的活動范圍和軌跡，記錄其于5 min 內進入開臂（open arm entry，OE）和閉臂的次數(shù)（close arm entry，CE）及在開臂與閉臂內的運動時間。以小鼠開臂進入次數(shù)與總入臂次數(shù)的百分率（percentage of entries to the open arms，OE%）及在開臂內運動時間與入臂的總時間百分率（percentage of entries to the close arms，OT%）作為抗焦慮作用評價的指標。

2.4 曠場實驗

曠場實驗考察動物總體的活動性和探究行為，在進行此項實驗之前至少 12 h，小鼠不能接受任何應激[15]。曠場區(qū)域是由一個 250 mm×250 mm 的底面、四面300 mm 的高壁構成。底部用標記筆分割成16 個（40 mm×40 mm）相同大小的區(qū)域。測試開始時，將小鼠置于中央四格區(qū)域中，然后通過設備上方預先固定的攝像機監(jiān)測5 min 內小鼠在開場中的活動情況，并通過與攝像機連接的監(jiān)視器記錄小鼠的活動軌跡，進而分析小鼠直立次數(shù)、進入曠場中央區(qū)域的次數(shù)、停留時間及總路程等指標。

2.5 孔板實驗

孔板實驗于一個體積參數(shù)為440 mm（長）×400 mm（寬）×270 mm（高）的木箱中進行，其底部4 個孔的孔徑均為30 mm，厚18 mm，每孔中心離最近壁的距離為100 mm，孔板箱壁及每一孔周邊都裝有紅外光電管，并與計算機相聯(lián)，自動記錄動物的鉆頭次數(shù)和鉆頭時間[16]。實驗時，將小鼠放置于孔板中央，背對實驗員進行考察。以動物兩眼消失在洞中為一次鉆頭動作，記錄5 ～10 min 內小鼠的鉆頭次數(shù)及持續(xù)時間。

2.6 明暗箱實驗

明暗箱實驗于一個400 mm（長）×400 mm（寬）×120 mm（高）的有機玻璃敞箱中進行。于其中央安裝一個100 mm（長）×100 mm（寬）×120 mm（高）的暗箱，構成另兩對角的L 形跑道（明箱），每個暗箱各有一個35 mm×35 mm 的洞口與兩側的跑道相連[17]。裝置上方裝有電視掃描和攝像系統(tǒng)，由此觀察小鼠的穿箱次數(shù)、在明箱滯留時間及運動活性。實驗時，將小鼠一起置于明箱中央，背朝通道。然后，觀察5 min 內小鼠的活動情況并記錄其于明箱中的停留時間和穿箱次數(shù)。每只小鼠考察完成后，用濕海綿將明暗箱徹底清洗并擦拭晾干，以排除殘留氣味對后期測試小鼠行為的影響。

2.7 小鼠海馬組織內 GABA 和Glu 水平測定[18]

在行為學實驗結束后第2日，立即將實驗動物斷頭處死，打開顱蓋和腦膜，冰臺上迅速分離海馬組織，稱重并置液氮中冷凍保存。實驗時，切取約100 mg 海馬組織并放入盛有磷酸鹽緩沖液的燒杯中，在冰浴條件下將其制成10%的勻漿液。將勻漿液轉入離心管內，低溫條件下3000 r·min－1離心15 min。棄去沉淀，取上清液，按照ELISA 試劑盒的操作步驟于450 nm 波長處檢測各孔中GABA 和Glu 的吸光度（OD）值（實際樣品OD值＝測得樣品OD值－空白OD值），經繪制的標準曲線計算出相應的濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)，計算小鼠海馬組織中GABA 和Glu 的含量。

2.8 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”的形式表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行組間的單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 柏子仁對焦慮癥小鼠的高架十字迷宮實驗結果

與空白對照組相比較，模型組小鼠進入開臂的停留時間和開臂進入次數(shù)百分率均顯著降低（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，不同給藥劑量的柏子仁組小鼠進入開臂停留時間和開臂進入次數(shù)百分率均有所增加，且呈現(xiàn)一定的劑量相關性，表現(xiàn)出抗焦慮作用。結果見表1。

表1 小鼠高架十字迷宮實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 1 Elevated plus maze test for mice ( ±s，n ＝12)

表1 小鼠高架十字迷宮實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 1 Elevated plus maze test for mice ( ±s，n ＝12)

注：與空白對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。Note：vs the blank control group，#P ＜0.05；vs the model group，*P ＜0.05.

開臂進入次數(shù)百分率（OT）/%柏子仁高劑量組40037.35±2.37*39.62±3.77*柏子仁中劑量組20031.25±1.38*32.34±3.20*柏子仁低劑量組10027.35±2.4227.54±2.12陽性藥物組 141.03±2.42*44.20±2.89*模型組－25.32±1.98#26.22±2.98#空白對照組－53.46±2.9056.78±1.98組別劑量/（mg·kg－1）開臂停留時間百分率（OE）/%

3.2 柏子仁對焦慮小鼠的曠場實驗結果

與空白對照組比較，模型組小鼠主要在曠場的四周活動，而在中心區(qū)域幾乎沒有活動，表明小鼠的焦慮非常明顯（P＜0.05）。與模型組比較，小鼠在曠場中心區(qū)域的活動各給藥組均有所增加，其中柏子仁高劑量組和陽性藥物組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示柏子仁在小鼠曠場實驗中表現(xiàn)出抗焦慮作用（見表2）。

表2 小鼠曠場實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 2 Open field test for mice ( ±s，n ＝12)

表2 小鼠曠場實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 2 Open field test for mice ( ±s，n ＝12)

注：與模型組比較，*P ＜0.05。Note：vs the model group，*P ＜0.05.

組別劑量/（mg·kg－1）總路徑/cm中心區(qū)域停留時間/s中心區(qū)域進入次數(shù)/次直立次數(shù)/次柏子仁高劑量組400 25 175.41±392.43* 24.82±1.31* 4.95±0.83* 25.45±2.12*柏子仁中劑量組20021 742.55±338.7520.78±1.153.27±1.1421.08±1.93柏子仁低劑量組10018 978.45±253.2418.42±1.452.98±1.2920.89±2.18陽性藥物組 1 26 458.52±269.45* 26.17±2.43* 5.92±1.17* 28.79±2.04*模型組－19 042.78±289.7817.37±1.892.15±0.7217.52±1.98空白對照組－32 789.42±276.5829.79±1.677.18±1.1732.48±1.45

3.3 柏子仁對焦慮小鼠的孔板實驗結果

與空白對照組比較，模型組小鼠的鉆頭次數(shù)及鉆頭持續(xù)時間明顯減少（P＜0.05）。與模型組比較，小鼠鉆頭次數(shù)和鉆頭持續(xù)時間各給藥組均增加，其中柏子仁高劑量組及陽性藥物組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示柏子仁在小鼠孔板實驗中表現(xiàn)出抗焦慮作用（見表3）。

表3 小鼠孔板實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 3 Hole board test for mice ( ±s，n ＝12)

表3 小鼠孔板實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 3 Hole board test for mice ( ±s，n ＝12)

注：與空白對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。Note：vs the blank control group，#P ＜0.05；vs the model group，*P ＜0.05.

組別劑量/（mg·kg－1）鉆頭次數(shù)/次鉆頭持續(xù)時間/s柏子仁高劑量組400 43.25±1.77* 43.70±3.52*柏子仁中劑量組20037.22±1.9839.20±2.20柏子仁低劑量組10033.45±2.1736.35±3.05陽性藥物組 1 48.57±2.24* 50.74±2.85*模型組－ 31.58±2.04# 35.54±2.54#空白對照組－60.78±1.7864.28±2.95

3.4 柏子仁對焦慮小鼠的明暗箱實驗結果

與空白對照組比較，模型組小鼠在明箱中的停留時間及穿箱次數(shù)明顯減少（P＜0.05），表明造模成功；與模型組比較，各給藥組小鼠在明暗箱中的停留時間和穿行次數(shù)均有明顯增加，其中柏子仁高劑量組和陽性藥物組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表4）。

表4 小鼠高明暗箱實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 4 Light/dark box test for mice ( ±s，n ＝12)

表4 小鼠高明暗箱實驗結果( ±s，n ＝12)Tab 4 Light/dark box test for mice ( ±s，n ＝12)

注：與空白對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。Note：vs the blank control group，#P ＜0.05；vs the model group，*P ＜0.05.

組別劑量/（mg·kg－1）明箱停留時間/s 穿箱次數(shù)/次柏子仁高劑量組400 90.53±6.52* 24.01±1.44*柏子仁中劑量組200 73.58±5.8720.02±2.04柏子仁低劑量組100 68.97±4.8718.95±1.67陽性藥物組 1 93.78±5.78* 26.62±2.76*模型組－ 62.42±4.58# 17.91±2.12#空白對照組－117.58±6.7830.42±4.02

3.5 焦慮小鼠海馬內GABA 和Glu 水平測定

與模型組比較，柏子仁高劑量組小鼠海馬GABA 水平顯著增加、Glu 水平顯著降低。提示柏子仁可能通過增加海馬GABA 的水平和降低海馬Glu 的水平來發(fā)揮抗焦慮作用（見表5）。

表5 小鼠海馬組織中GABA 和Glu 的測定結果( ±s，n ＝12)Tab 5 Content of GABA and Glu in the hippocampal tissue in the mice ( ±s，n ＝12)

表5 小鼠海馬組織中GABA 和Glu 的測定結果( ±s，n ＝12)Tab 5 Content of GABA and Glu in the hippocampal tissue in the mice ( ±s，n ＝12)

注：與空白對照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。Note：vs the blank control group，#P ＜0.05；vs the model group，*P ＜0.05.

Glu/（μg·g－1）柏子仁高劑量組4004.028±0.782*3.125±0.245*柏子仁中劑量組2003.357±0.6553.320±0.135柏子仁低劑量組1003.022±0.4813.502±0.256陽性藥物組 14.283±0.988*3.029±0.348*模型組－2.742±0.7983.452±0.256空白對照組－4.662±0.5872.994±0.184組別劑量/（mg·kg－1）GABA/（μmol·L－1）

4 討論

從醫(yī)學角度上講，焦慮癥是因為神經元之間興奮和抑制傳遞不平衡，導致神經回路信息傳導不暢引發(fā)的。GABA 與Glu 作為重要的神經遞質，在焦慮癥中發(fā)揮重要的作用。當人體內GABA 缺乏時，會產生焦慮、疲倦、憂慮等情緒。Glu 是一種重要的中樞神經系統(tǒng)興奮性遞質，與人體焦慮情緒密切相關。因此，測定海馬GABA 和Glu的水平可以間接反映焦慮癥患者的病程，選擇合適的可以增加海馬GABA 水平和降低海馬Glu 水平的藥物，可達到治療焦慮癥的目的。越來越多的研究表明，中藥在抗焦慮方面具有很大的研究價值和開發(fā)潛力[19-20]。

本實驗采用乙醇超聲法可以提取出柏子仁的主要藥效成分， 如揮發(fā)油及脂肪油等，有利于研究柏子仁的藥效學及相關機制[21-22]。進而采用經典、公認的動物模型評價柏子仁的抗焦慮作用。其中，高架十字迷宮和曠場實驗利用動物對新環(huán)境的探究和恐懼之間的矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態(tài)，既可以建立模型也可測量焦慮反應，更能反映藥物的抗焦慮作用?？装鍖嶒灴捎糜诳疾靹游镌谔囟ōh(huán)境下的情緒和焦慮狀態(tài)及對應激的反映。明暗箱實驗中的明箱停留時間是最有效的藥物抗焦慮作用評價指標。

結果表明本次實驗模型成功構建，柏子仁醇提物給藥組在各模型上均表現(xiàn)出抗焦慮的行為學特征，其中柏子仁高劑量組與模型組比較可以顯著改善小鼠的行為表現(xiàn)，具有明顯的抗焦慮作用。柏子仁提取物高劑量組可以顯著提高焦慮小鼠海馬GABA 的水平和顯著降低Glu 的水平，表明柏子仁抗焦慮作用機制可能與調節(jié)海馬的GABA 及Glu 的水平有關。本研究為柏子仁的臨床合理應用提供可靠依據(jù)，也為進一步研究柏子仁的藥效和作用機制提供參考。

焦慮癥的發(fā)生機制復雜，雖然在本次實驗選擇的動物模型當中，柏子仁提取物表現(xiàn)出較理想的抗焦慮作用，且可以改變腦內神經遞質GABA和Glu 的水平。但是，由于實驗條件的限制，對其機制的探討尚需加強。后續(xù)研究需結合病理改變及神經遞質的信號傳導通路，以進一步深入闡明柏子仁的抗焦慮作用機制，為其臨床應用和產品開發(fā)提供理論依據(jù)。