基于多指標(biāo)-響應(yīng)曲面法優(yōu)選“建昌幫”姜天麻提取工藝

周莉莉，張霞，彭巧珍，謝宇璐，葉喜德*，金鐳*（. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院藥劑科，合肥 00；. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 0004；. 南昌航空大學(xué)信息工程學(xué)院，南昌 006）

天麻為蘭科無(wú)綠葉并寄生草本植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖[1]。性甘、味平，入肝經(jīng)。具熄風(fēng)止痙、祛風(fēng)之痛之效，為治偏頭痛之要藥。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列之為上品[2]。天麻主含酚類、多糖、有機(jī)酸類、甾醇類、氨基酸及多種微量元素等成分[3]。

天麻炮制方法較多，如煨法、酒炙、蜜麩炒等，但未見(jiàn)炮制機(jī)制的研究。天麻姜制始載于《幼幼集成》[4]，后為江西“建昌幫”列為其特色飲片之一[5]。目前江西、廣東、福建等各地方炮制規(guī)范均收錄了姜天麻[6-8]，但均未見(jiàn)其炮制機(jī)制的研究?！敖ú龓汀闭J(rèn)為姜制天麻可增強(qiáng)其祛痰熄風(fēng)，定眩止痛之功。研究表明，天麻經(jīng)姜制后，其化學(xué)成分發(fā)生了變化，而且動(dòng)物行為學(xué)試驗(yàn)表明該炮制利于天麻對(duì)大鼠腦組織的保護(hù)[9-10]，且姜天麻對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)的大鼠偏頭痛抑制作用強(qiáng)于《中國(guó)藥典》收錄的天麻炮制品[11-12]。顯然，天麻經(jīng)姜制后藥效增強(qiáng)，與其發(fā)生的有效成分變化有關(guān)。但如何使這些成分充分溶出，仍缺乏最佳提取工藝?；谇捌谂谥破分苽涮接懙慕炻榕谥乒に嘯13]，本研究采用UPLC 定量分析，以天麻素，天麻苷元，對(duì)羥基苯甲酸，巴利森苷A、B、C、E 等多指標(biāo)為質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并結(jié)合響應(yīng)曲面法[14]對(duì)料液比、提取溫度及提取溶劑之間的交互作用進(jìn)行考察，優(yōu)選出姜天麻最佳提取工藝參數(shù)，提高該炮制品中有效成分得率，為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity（e2695）超高效液相色譜儀（新加坡Waters 公司）；TGL-16B 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AR240 十萬(wàn)分之一電子天平（Mettler Toledo 公司）；KQ-500E 超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

天麻素（批號(hào)：CHB190212）、 天麻苷原（CHB190214）、 對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)：CHB180226）、巴利森苷A（批號(hào)：CHB180222）、巴利森苷B（批號(hào)：CHB180223）、巴利森苷C（批號(hào)：CHB180224）、 巴利森苷E（批號(hào)：CHB180225）（對(duì)照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司）；水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純。

天麻、生姜于（代富安蟲(chóng)草參茸行，批號(hào)：20200173），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定分別為蘭科天麻（Gastrodia elataBlume.）干燥塊莖、植物姜（Zingiber officinaleRose.）的新鮮根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），體積流量0.2 mL·min－1，柱溫35℃。流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0 ～14 min，3%～29%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。理論塔板數(shù)按天麻素峰計(jì)算不低于5000。

2.2 對(duì)照品制備

精密稱取天麻素0.002 58 g、天麻苷元0.004 96 g、對(duì)羥基苯甲酸0.002 48 g、巴利森苷A0.002 54 g、巴利森苷B 0.004 97 g、巴利森苷C 0.002 37 g、巴利森苷E 0.002 22 g，用水溶液（乙腈-水＝3∶97）定容于5 mL 量瓶中。

2.3 供試品制備

2.3.1 姜天麻制備[13]按“建昌幫”炮制規(guī)范炮制，打粉過(guò)3 號(hào)篩，備用。

2.3.2 供試品制備 精密稱取姜天麻粉末1.00 g，置50 mL 錐形瓶中，加入20 mL 70%乙醇溶液，搖勻，靜置30 min，稱定重量，30℃超聲30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失量，過(guò)濾，取續(xù)濾液10 mL，揮去溶液，用水溶液（乙腈-水＝3∶97）溶解，定容置25 mL 量瓶。取溶液適量，離心（15 000 r·min－1、10 min），0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.3.3 混合對(duì)照品的制備 吸取“2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品天麻素200 μL、天麻苷元10 μL、對(duì)羥基苯甲酸20 μL、巴利森苷A 200 μL、巴利森苷B 200 μL、巴利森苷C 150 μL、巴利森苷E 250 μL 加入2 mL EP 管，高速離心后，過(guò)0.22 μm 濾膜，即得混合對(duì)照品。

2.4 方法學(xué)考察

分別精密吸取混合對(duì)照品、供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。天麻素，天麻苷元，對(duì)羥基苯甲酸，巴利森苷A、B、C、E 的保留時(shí)間分別為2.91、4.74、6.81、7.07、11.46、9.39、10.03 min?；旌蠈?duì)照品與供試品各成分分離度良好，見(jiàn)圖1。

圖1 天麻對(duì)照品（A）和供試品溶液（B）Fig 1 Gastrodia elata reference substance（A）and test solution（B）

2.4.1 線性關(guān)系考察 吸取“2.3.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋并進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linearity of each component

2.4.2 精密度考察 取混合對(duì)照品重復(fù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)。天麻素、天麻苷元和對(duì)羥基苯甲酸的峰面積RSD分別為0.68%、1.1%、1.3%；巴利森苷A、B、C、E 的峰面積RSD分別為0.19%、0.22%、0.46%、0.37%。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 于1、4、8、12、16、24 h測(cè)定同一份供試品溶液（7 號(hào)樣品）的穩(wěn)定性，得天麻素、天麻苷元和對(duì)羥基苯甲酸的峰面積RSD分別為0.27%、2.82%、3.0%；巴利森苷A、B、C、E 的峰面積RSD分別為1.3%、0.57%、2.1%、0.37%。

2.4.4 重復(fù)性考察 精密稱取同一炮制方法下姜天麻粉末1.00 g，依“2.3.2”項(xiàng)下方法（7 號(hào)樣品）制備，分別平行制備6 份。分別進(jìn)樣2 μL，測(cè)定峰面積，得天麻素、天麻苷元和對(duì)羥基苯甲酸的峰面積RSD分別為2.8%、2.0%、2.8%；巴利森苷A、B、C、E 的峰面積RSD分別為2.4%、2.8%、1.4%、1.5%。

2.4.5 加樣回收考察 精密量取已測(cè)定的供試品溶液 3 份，每份1 mL，分別按供試品的80%、100%、120%加入混合對(duì)照品溶液（天麻素0.100 mg·mL－1，天麻苷元0.010 mg·mL－1，對(duì)羥基苯甲酸0.010 mg·mL，巴利森苷A、B、C、E分別為0.099、0.193、0.059、0.108 mg·mL－1）每個(gè)平行3 份，進(jìn)樣測(cè)定各指標(biāo)含量，測(cè)得天麻素、天麻苷元和對(duì)羥基苯甲酸平均回收率（RSD）分別為103.12%（1.8%）、98.67%（2.8%）、100.34%（1.8%）。巴利森苷A、B、C、E 平均回收率（RSD）分別為101.56%（3.0%）、104.65%（1.8%）、99.13%（2.4%）、102.43%（2.5%）。

2.5 提取工藝單因素考察

由于天麻中巴利森苷類成分具有熱不穩(wěn)定性[15]。因此，選擇適宜的提取溶媒、提取時(shí)間和提取溫度是提高該類成分得率的主要因素。本研究選擇提取溶媒、提取時(shí)間、超聲溫度、提取時(shí)間、料液比、粒徑條件進(jìn)行考察。

稱取姜天麻粉末1.0000 g 5 份，固定其他條件不變，分別考察不同提取溶劑（水和不同濃度乙醇）、超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）、提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）、 粒徑（過(guò)10、24、50、60、80 目篩）對(duì)提取效率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同提取條件對(duì)提取效率的影響Fig 2 Effect of different extraction conditions on extraction efficiency

2.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

2.6.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)“2.5”項(xiàng)下單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面因素及水平Tab 2 Factor and level of response surface

2.6.2 試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)天麻目前研究進(jìn)展及藥理作用權(quán)重分配，確定綜合評(píng)分（Z）＝天麻素×30% ＋天麻苷元×20% ＋對(duì)羥基苯甲酸×10%＋巴利森苷A×10%＋巴利森苷B×10%＋巴利森苷C×10%＋巴利森苷E×10%。設(shè)計(jì)3 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，應(yīng)用Design-Expert V8.0.6 軟件，中心組合設(shè)計(jì)Box-Behnken 分析處理，得到3 因素3 水平共17 組試驗(yàn)。試驗(yàn)方案分析及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Response surface design

2.6.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面3D 圖（見(jiàn)圖3）分析可得，傾斜度越高說(shuō)明兩因素交互作用越明顯，并且顏色越深變化加劇[16]。由3D 響應(yīng)圖可知溶劑與溫度、料液比交互作用顯著，響應(yīng)面存在極值，由等高圖可得提取溫度對(duì)綜合得分的影響大于提取溶劑與料液比。

圖3 提取溶劑（A）、提取溫度（B）、料液比（C）交互作用Fig 3 Interaction of extraction solvent（A），extraction temperature（B）and solid-liquid ratio（C）

最后得到姜制天麻最佳工藝條件為70%乙醇提取溶劑，提取溫度78.49℃，料液比1∶15，天麻素，天麻苷元，對(duì)羥基苯甲酸及巴利森苷A、B、C、E 和綜合得分預(yù)測(cè)值分別為0.2641、0.0066、0.0107、0.2759、0.11676、0.1170、0.3294、1.7599 mg·g－1。基于此，結(jié)合單因素和實(shí)際生產(chǎn)考慮，姜制天麻工藝條件可為清蒸切片潤(rùn)制，70%乙醇、80 ℃、1∶15 超聲提取40 min。

2.6.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取1.0000 g 姜天麻3 份，按照優(yōu)選最佳工藝進(jìn)行提取，結(jié)果平均綜合評(píng)分為1.8083 與模型預(yù)測(cè)值（1.7599）相近，相對(duì)誤差小于5%。

3 討論

課題組前期相繼開(kāi)展了姜天麻炮制前后主成分差異、藥效等方面研究[17-19]，證實(shí)了天麻經(jīng)姜制后可使其藥效增強(qiáng)，并與炮制后的變化成分密切相關(guān)，但未就姜天麻有效成分提取工藝開(kāi)展研究。而響應(yīng)曲面法依據(jù)試驗(yàn)中的隨機(jī)誤差，可連續(xù)對(duì)試驗(yàn)中各個(gè)水平進(jìn)行分析，能用相對(duì)較少的試驗(yàn)次數(shù)，對(duì)試驗(yàn)因素水平中的交互作用做較全面的分析[20-22]。因此，本試驗(yàn)采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法對(duì)姜天麻提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

對(duì)天麻化學(xué)成分研究，常選擇天麻素和天麻苷元為主，其工藝優(yōu)化也多局限于單個(gè)成分。但隨著研究的深入，天麻中酚類成分更多地被證實(shí)為其入血效應(yīng)成分。如巴利森苷A、B 分別具有改善學(xué)習(xí)記憶力、抗哮喘等作用[23-25]。為此，本試驗(yàn)在考察提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取溶劑、提取粒徑等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溶劑、料液比和提取溫度的交互作用進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)，以天麻素，天麻苷元，對(duì)羥基苯甲酸，巴利森苷A、B、C、E 為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，建立了天麻7 種主要成分UPLC 含量測(cè)定方法，確定“建昌幫”姜天麻最佳提取工藝，且綜合評(píng)價(jià)優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行，響應(yīng)模型擬合度良好，達(dá)到工藝優(yōu)化目的。

表4 差分析Tab 4 Variance analysis