注射用曲札茋苷類過敏反應(yīng)檢測(cè)體系的應(yīng)用

楊炳治，楊旭娟，黃茜，曹亞茹，劉國(guó)光，劉一丹*（1. 麗江文化旅游學(xué)院，云南 麗江 674100；.昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院，昆明 650100）

中藥注射劑是我國(guó)特有的中藥劑型，已有幾十年的發(fā)展歷史。隨著科技進(jìn)步，中藥注射劑作為現(xiàn)代中藥劑型的發(fā)展方向之一，已廣泛應(yīng)用于危重疾病急救及感染性疾病、心腦血管疾病和惡性腫瘤等的治療，在保障人類健康中發(fā)揮著重要作用[1]。然而，中藥注射劑通常是由多種藥材組成的復(fù)方，每味中藥成分復(fù)雜多樣，部分中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還未明確。此外中藥材的質(zhì)量受產(chǎn)地、采收季節(jié)影響較大，因產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、采摘時(shí)間、存放時(shí)間長(zhǎng)短不同等，導(dǎo)致同種藥材的有效或有毒成分含量不同[2]，容易出現(xiàn)安全隱患。劉爽等[3]報(bào)道的文獻(xiàn)中，整理了2010—2015年各年度國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)通報(bào)的中藥注射劑排名情況，可見排名始終位居前列的有清開靈注射液、參麥注射液、雙黃連注射液。易艷等[4]報(bào)道的文獻(xiàn)中，不良反應(yīng)報(bào)道較多的3 種中藥注射劑，分別為魚腥草注射液、生脈注射液和清開靈注射液，結(jié)果顯示臨床1.5 倍和3.3 倍濃度的生脈注射液和清開靈注射液均可以引發(fā)小鼠發(fā)生以血管通透性增高為主要表現(xiàn)的輕微類過敏反應(yīng)，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。因此陽性對(duì)照物除了化合物Compound48/80（C48/80）還增加了清開靈注射液。

注射用曲札茋苷是從拉薩大黃藥材乙醇提取物中分離、純化得到，具有抗氧化、抗炎、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用；能縮小缺血再灌注引起的腦梗死面積、減輕腦水腫，能改善腦卒中動(dòng)物的行為學(xué)障礙、促進(jìn)神經(jīng)缺失癥狀的恢復(fù)。注射用曲札茋苷是昆藥集團(tuán)獨(dú)創(chuàng)的一類創(chuàng)新藥，目前已獲得臨床批件（No.2018L02062）。本文旨在建立RBL-2H3 細(xì)胞脫顆粒體外類過敏檢測(cè)體系，對(duì)中藥注射劑安全性進(jìn)行快速初步評(píng)價(jià)，再結(jié)合小鼠體內(nèi)類過敏檢測(cè)體系進(jìn)行綜合分析，為企業(yè)中藥注射劑類過敏反應(yīng)做出及早預(yù)警和消除隱患提供一定技術(shù)手段，同時(shí)為企業(yè)注射劑再評(píng)價(jià)工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

注射用曲札茋苷（昆藥集團(tuán)藥物研究院，批號(hào)：170101，規(guī)格：20 mg/瓶）；C48/80（Sigma 公司，批號(hào)：Lot#056M4067V，－20℃保存）；清開靈注射液（吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：17011604，規(guī)格：2 mL/支）。伊文思藍(lán)（EB，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：M26S6L3294）；甲酰胺（生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：CB18BA0025）；MEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司，批號(hào)：AC11016265）；胎牛血清（Gibco 公司，批號(hào)：1778586）；青-鏈霉素（BI 公司，批號(hào)：1731651）；PBS 緩沖液（Biosharp 公司，批號(hào)：67035331）；曲拉通X-100（TritonX-100，批號(hào)：20161121，規(guī)格：500 mL/瓶）；氯化鈉注射液（浙江國(guó)鏡藥業(yè)有限公司，批號(hào)：A170525A1）；ELISA 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：201801）；噻唑藍(lán)（MTT，Aladdin 公司，批號(hào)：A1720090）；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：BCBH5215V，Sigma 公司）。

1.2 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞株（RBL-2H3，廣州吉妮歐生物科技有限公司）。SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g [昆藥集團(tuán)動(dòng)物室，生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2014-0001]。SPF 級(jí)雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g [昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2015-0002]。飼養(yǎng)于IVC 動(dòng)物室，溫度20 ～25℃，濕度40%～70%，12 h 明暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器

PowerWaveXS2 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BioTek，Gene Company Limited）；XK96-A 快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（Merch Millipore 德國(guó)）；SYNERGY HT 多功能酶標(biāo)儀（BioTex 公司）；XD-202 倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Themo 公司）；STS-3脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司）；96 孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板（Gibco 公司）；各系列量程手動(dòng)移液器及離心管、不同規(guī)格Tip 頭（Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 體外檢測(cè)方法建立

2.1.1 細(xì)胞活力的測(cè)定[5-6]將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液，按接種密度分為4 組：0.5×104、1×104、2×104、2.5×104個(gè)/孔，分別于0、6、12、24、36、48、60 h 取樣檢測(cè)細(xì)胞活力，分別于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)前4 h 給予MTT 液，50 μL/孔，并補(bǔ)足培養(yǎng)液至200 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去上清液，加入DMSO（200 μL/孔）震蕩溶解5 min，于570 nm 處測(cè)定吸光度（OD）。

2.1.2β-氨基己糖苷酶釋放率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期RBL-2H3 細(xì)胞，加入96 孔板隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（氯化鈉注射液）、陽性對(duì)照組（C48/80 40 μg·mL－1或清開靈注射液1/32 原液、1/64 原液、1/128 原液）、注射用曲札茋苷組（200、100、50 μg·mL－1），每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，每孔250 μL，培養(yǎng)1 h 后，取上清液，4℃、4000 r·min－1離心20 min，收集上清液；原細(xì)胞孔每孔加入250 μL 的0.1%TritonX-100，作用30 min，取上清液，4℃、4000 r·min－1離心20 min，收集上清液。在96 孔酶標(biāo)板上，每孔加入β-氨基糖苷（7 mmol·L－1）50 μL，0.1%TritonX-100 5 μL， 各組上清液45 μL，37℃孵育90 min 后，每孔加入終止液NaCO3-NaHCO3150 μL，在405 nm 處使用酶標(biāo)儀檢測(cè)光吸收A值；β-氨基己糖苷酶釋放率（%）＝[（各組上清樣品酶活性光吸收A值－調(diào)零孔光吸收A值）/（各組上清樣品酶活性光吸收A值＋各組細(xì)胞裂解孔光吸收A值－調(diào)零孔光吸收A值）]×100%。

2.1.3 組胺釋放率的測(cè)定 按ELISA 試劑盒說明，利用酶標(biāo)儀分別測(cè)定待測(cè)的細(xì)胞上清和裂解后細(xì)胞上清的光吸收A值，計(jì)算藥物作用后細(xì)胞組胺釋放率。組胺釋放率（%）＝各組組胺上清釋放量/（各組組胺上清釋放量＋各組細(xì)胞裂解組組胺量）×100%。

2.2 注射用曲札茋苷體內(nèi)檢測(cè)類過敏反應(yīng)

2.2.1 小鼠體內(nèi)檢測(cè)體系的建立[7]取60 只雄性ICR 小鼠，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（氯化鈉注射液）、陽性對(duì)照組[C48/80 1.25 mg·mL－1或相當(dāng)于臨床劑量20 倍和10 倍的清開靈高、低劑量組（0.7、0.35 mL）]、相當(dāng)于臨床劑量50 倍和30倍數(shù)的注射用曲札茋苷高、低劑量組（1.75、1.05 mg·mL－1）受試組，每組10 只。將含有0.8%伊文思藍(lán)（EB）指示劑與各給藥組按體積比1∶1進(jìn)行配制，以20 mL·kg－1靜脈注射（iv）給藥。30 min 后，摘眼球取血，并分別用肝素抗凝管和普通離心管收集血液各約1 mL，放置2 h 后，3000 r·min－1離心5 min，收集上清液待測(cè)。脫頸椎處死小鼠，沿小鼠耳廓剪下耳朵，并記錄小鼠耳朵反應(yīng)率[反應(yīng)率（%）＝出現(xiàn)耳廓藍(lán)染的動(dòng)物數(shù)/組內(nèi)動(dòng)物數(shù)×100%]，剪碎小鼠耳朵，放入5 mL 的離心管中，加入2 mL/管甲酰胺浸泡48 h[8-9]。昆明種小鼠模型建立與ICR 小鼠相同。

2.2.2 伊文思藍(lán)滲出量及其升高率的計(jì)算 小鼠耳朵浸泡48 h 后，4000 r·min－1離心20 min，取上清液，加入96 孔酶標(biāo)板中，每孔200 μL，酶標(biāo)儀610 nm 處測(cè)定光吸收A值，并計(jì)算EB 滲出量（μg），EB 滲出升高率（%）＝（測(cè)試組EB 含量－對(duì)照組EB 含量）/對(duì)照組EB 含量×100%。

2.2.3 ELISA 法檢測(cè)動(dòng)物血液中組胺、IgE 及VEGF 含量 離心所收集的血液、血漿和血清按ELISA 試劑盒說明分別測(cè)定組胺、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與免疫球蛋白（IgE），計(jì)算含量。

2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用IBM SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較，采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 方法比較，P≤0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 RBL-2H3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 由于對(duì)數(shù)期細(xì)胞代謝最活躍，對(duì)外界刺激敏感性最強(qiáng)，是進(jìn)行藥物影響實(shí)驗(yàn)的最佳對(duì)象。根據(jù)圖1 的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，可知接種密度為0.5×104個(gè)/孔在所選時(shí)間段內(nèi)一直處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此細(xì)胞最佳種植密度為：0.5×104個(gè)/孔、作用時(shí)間為24 h。

圖1 RBL-2H3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig 1 RBL-2H3 cell growth curve

3.1.2β-氨基己糖苷酶和組胺釋放率 從表1 可以看出，與陰性對(duì)照組相比，C48/80、清開靈注射液1/32 原液組、1/64 原液組β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺釋放率顯著升高（P＜0.01）；注射用曲札茋苷各劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 細(xì)胞上清β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺釋放率 ( ±s，n ＝3)Tab 1 Release rate and histamine release rate of cell supernatant β-aminoglycosidase ( ±s，n ＝3)

表1 細(xì)胞上清β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺釋放率 ( ±s，n ＝3)Tab 1 Release rate and histamine release rate of cell supernatant β-aminoglycosidase ( ±s，n ＝3)

注：與陰性對(duì)照組相比，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，**P ≤0.01.

組別體系終濃度β-氨基己糖苷酶釋放率/%組胺釋放率/%陰性對(duì)照組－ 6.30±2.8358.80±2.78 C48/8040 μg·mL－119.16±1.50**70.84±5.64**清開靈注射液1/32 原液29.32±1.60**77.66±7.48**1/64 原液15.35±2.15**70.03±2.26**1/128 原液 8.81±1.0864.37±4.69注射用曲札茋苷 200 μg·mL－110.32±1.9263.89±3.50 100 μg·mL－1 9.99±1.5553.69±2.65 50 μg·mL－110.56±2.3349.36±7.34

3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 ICR 小鼠血管通透性情況 從表2 可以看出，與陰性對(duì)照組相比，C48/80 與相當(dāng)于臨床劑量倍數(shù)20 倍和10 倍的清開靈高、低劑量組中EB 滲出量升高（P＜0.01）；相當(dāng)于臨床劑量30倍和50 倍的注射用曲札茋苷組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中C48/80、清開靈注射液高、低劑量EB升高率≥150%，類過敏較嚴(yán)重[10-11]。

表2 受試物誘導(dǎo)ICR 小鼠耳廓血管通透性增高反應(yīng)(n ＝10)Tab 2 Increased auricle vascular permeability induced by test substance in ICR mice (n ＝10)

3.2.2 ELISA 試劑盒檢測(cè)ICR 小鼠相關(guān)因子 從表3 可以看出，與陰性對(duì)照組相比，C48/80、清開靈注射液高、低劑量組的VEGF 和組胺明顯升高（P＜0.01）；清開靈高、低劑量組的IgE 明顯降低（P＜0.01）；注射用曲札茋苷高、低劑量組IgE、VEGF、組胺差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 ELISA 試劑盒測(cè)ICR 小鼠相關(guān)因子( ±s，n ＝10)Tab 3 Detection of related factors in ICR mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

表3 ELISA 試劑盒測(cè)ICR 小鼠相關(guān)因子( ±s，n ＝10)Tab 3 Detection of related factors in ICR mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

注：與陰性對(duì)照組相比，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，**P ≤0.01．

組別濃度IgE/（ng·mL－1）VEGF/（ng·mL－1）組胺/（ng·mL－1）陰性對(duì)照組（0.4%EB）－71.02±5.41 5.59±2.140.15±0.12 C48/801.25 mg·mL－161.67±12.5713.07±2.71**0.53±0.16**清開靈注射液0.7 mL50.96±6.07**11.05±2.07**0.55±0.14**0.35 mL48.55±16.64** 9.98±1.34**0.44±0.16**注射用曲札茋苷組1.75 mg·mL－159.78±12.04 6.25±1.070.25±0.09 1.05 mg·mL－157.23±14.64 7.62±0.580.24±0.09

3.2.3 ICR 小鼠耳朵藍(lán)染情況 ICR 小鼠耳朵藍(lán)染情況見圖2，C48/80 組反應(yīng)率為100%；清開靈高、低劑量組反應(yīng)率為80%。注射用曲札茋苷高劑量耳藍(lán)染動(dòng)物數(shù)為3，反應(yīng)率為30%，低劑量耳藍(lán)染動(dòng)物數(shù)為2，反應(yīng)率為20%。

圖2 ICR 小鼠耳朵藍(lán)染情況Fig 2 ICR mice the conditions of auricle blue staining

3.2.4 昆明種小鼠血管通透性情況 表4結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，C48/80 組與相當(dāng)于臨床劑量倍數(shù)20 倍和10 倍的清開靈高、低劑量組EB 滲出量升高（P＜0.01）；相當(dāng)于臨床劑量倍數(shù)50 倍和30倍的注射用曲札茋苷組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 受試物誘導(dǎo)昆明種小鼠耳廓血管通透性增高反應(yīng)(n ＝10)Tab 4 Increased auricle vascular permeability induced by test substance in Kunming mice (n ＝10)

3.2.5 ELISA 試劑盒檢測(cè)昆明種小鼠相關(guān)因子從表5 可以看出，與陰性對(duì)照組相比，清開靈高、低劑量組和注射用曲札茋苷高、低劑量組IgE 降低（P＜0.01）；C48/80 組、清開靈高、低劑量組組胺含量升高（P＜0.01）；C48/80 組、清開靈高、低劑量組VEGF 升高（P＜0.01，P＜0.05）；注射用曲札茋苷組高、低劑量組VEGF、組胺差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 ELISA 試劑盒測(cè)昆明種小鼠相關(guān)因子( ±s，n ＝10)Tab 5 Detection of related factors in Kunming mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

表5 ELISA 試劑盒測(cè)昆明種小鼠相關(guān)因子( ±s，n ＝10)Tab 5 Detection of related factors in Kunming mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

注：與陰性對(duì)照組相比，*P ≤0.05，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，*P ≤0.05，** P ≤0.01.

組別濃度IgE/（ng·mL－1）VEGF/（ng·mL－1）組胺/（ng·mL－1）陰性對(duì)照組（0.4%EB）－62.35±7.44 6.46±2.290.35±0.23 C48/801.25 mg·mL－152.50±10.2711.74±1.6**0.61±0.12**清開靈注射液0.7 mL41.88±18.92**10.22±1.5**0.63±0.13**0.35 mL39.29±10.35** 9.48±1.65*0.61±0.12**注射用曲札茋苷組1.75 mg·mL－141.45±7.59** 7.95±1.840.35±0.16 1.05 mg·mL－142.23±14.93** 5.59±2.070.25±0.09

3.2.6 昆明種小鼠耳朵藍(lán)染情況 昆明種小鼠耳朵藍(lán)染情況見圖3，C48/80 組反應(yīng)率為100%，清開靈高劑量組反應(yīng)率為100%，清開靈低劑量組反應(yīng)率為90%；注射用曲札茋苷高、低劑量組反應(yīng)率為0。

圖3 昆明種小鼠耳朵藍(lán)染情況Fig 3 Auricle blue staining in Kunming mice

4 討論

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局要求注射用曲札茋苷申報(bào)臨床批件時(shí)要有更靈敏的過敏反應(yīng)檢測(cè)方法，而目前國(guó)際上缺乏對(duì)類過敏檢測(cè)的統(tǒng)一方法，公認(rèn)的有非免疫介導(dǎo)IgE、類過敏所致靶細(xì)胞脫顆粒機(jī)制、激活補(bǔ)體系統(tǒng)機(jī)制、激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)途徑、急性過敏途徑以及細(xì)胞骨架重排；體內(nèi)模型的建立主要依據(jù)的是非免疫介導(dǎo)IgE 機(jī)制與釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致血管通透性增加；釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致血管通透性增加從而引發(fā)類過敏反應(yīng)的概念已比較成熟。與此同時(shí)非免疫介導(dǎo)IgE 機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證，力爭(zhēng)有更為詳實(shí)的數(shù)據(jù)支持。

本研究通過試劑盒檢測(cè) ICR 小鼠和昆明種小鼠的相關(guān)因子，發(fā)現(xiàn)C48/80 組的IgE 與陰性對(duì)照組相比沒有明顯差異；但在ICR 小鼠中，清開靈高、低劑量組IgE 與陰性對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在昆明種小鼠中，清開靈和注射用曲札茋苷高、低劑量組IgE 與陰性對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；所有組別的IgE 與陰性對(duì)照組相比，都具有明顯的下降趨勢(shì)。為了進(jìn)一步明確類過敏反應(yīng)的作用趨勢(shì)，后期需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

RBL-2H3 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的嗜堿性顆粒，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生類過敏反應(yīng)時(shí)，會(huì)釋放組胺、β-氨基己糖苷酶等各類細(xì)胞因子[12-13]。其中組胺是經(jīng)典的過敏介質(zhì)，但檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定和重復(fù)性較差，需要在短時(shí)間內(nèi)迅速完成實(shí)驗(yàn)測(cè)定[14]。VEGF 亦被稱為血管通透因子，是一種分泌型多肽和強(qiáng)力內(nèi)皮細(xì)胞分裂劑。VEGF 能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，產(chǎn)生一系列細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致微血管內(nèi)皮通透性增高[15-16]。C48/80 能夠激活G 蛋白，進(jìn)而激活蛋白激酶C 和Ca2＋通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞內(nèi)的顆粒囊泡移向胞漿膜并釋放生物介質(zhì)，從而引發(fā)類過敏反應(yīng)[17-18]。EB 是一種無明顯毒性的藍(lán)色染料，可迅速與血漿蛋白（主要為白蛋白）結(jié)合，形成蛋白結(jié)合物[19-20]。當(dāng)血管通透性升高時(shí)，其可隨著血漿蛋白滲出到血管外的組織間隙中，造成組織明顯藍(lán)染，以反應(yīng)率、EB滲出升高率為指標(biāo)，定量定性分析樣品在小鼠體內(nèi)類過敏的反應(yīng)程度[21]。

綜上所述，EB 滲出量與藥物劑量成正相關(guān)趨勢(shì)，且ICR 小鼠較為敏感，本研究通過對(duì)注射用曲札茋苷的初步評(píng)價(jià)可得其在該體內(nèi)外體系中不存在類過敏反應(yīng)，安全性較高，這也對(duì)其用法用量提供一定的指導(dǎo)意義。