注射用神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)炎癥的改善作用及機(jī)制▲

歐詒丹 陳 靜 高元杰

(海南省儋州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，儋州市 571700，電子郵箱：flower1988@163.com)

癲癇是一種由大腦神經(jīng)元異常過(guò)度放電引起的反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。癲癇發(fā)作持續(xù)30 min以上，或在短時(shí)間內(nèi)頻繁發(fā)作而不能自止的狀態(tài)，稱為癲癇持續(xù)狀態(tài)[2]。若癲癇持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或多次反復(fù)發(fā)作，可造成不可逆的腦損傷，導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙[3]。丙戊酸鈉、卡馬西平和苯妥英鈉等是目前臨床常用的抗癲癇藥物，但仍有20%～30%的癲癇患者經(jīng)治療后還會(huì)頻繁發(fā)作并發(fā)展為難治性癲癇[4]。同時(shí)，常規(guī)抗癲癇藥物伴存在多種不良反應(yīng)，這些不良反應(yīng)也影響了患者服藥的依從性。因此，尋找療效較好且副作用小的抗癲癇藥物成為當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的常用藥，癲癇持續(xù)狀態(tài)是造成患者神經(jīng)損傷的主要病因，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠穿透血腦屏障，有效促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[5-7]。近年來(lái)，大量研究顯示癲癇發(fā)作引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦組織病理改變以及認(rèn)知功能損傷的重要原因[8-10]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)-髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號(hào)通路在癲癇發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9]，深入研究其與神經(jīng)炎癥及癲癇發(fā)作的關(guān)系，有利于進(jìn)一步闡明癲癇發(fā)病的機(jī)制。本研究主要分析注射用神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)炎癥的改善作用并基于TLR4-MyD88通路探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物及試劑 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液(20 mg/支)購(gòu)自北京賽升藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：20193881)；丙戊酸鈉片(500 mg/片)購(gòu)自山東仁和堂藥業(yè)有限公司(批號(hào)：20200427)；氯化鋰(100 g/瓶)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)：310468)；鹽酸毛果蕓香堿(5 g/瓶)購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司(批號(hào)：1538901CAS)；溴甲基東莨菪堿(25 mg/瓶)購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品(批號(hào)：190213)；地西泮(2 mL/10 mg)購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司(批號(hào)：190301)。Nissl染色試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司(批號(hào)：1922S04)；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自上海酶科(批號(hào)：20200125、20200311、20200214)；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)：017K6145)，TLR-4抗體、核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)抗體、MyD88抗體、β-肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自R&D公司(批號(hào)：220645、223712、220428、220635)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Abcam公司(批號(hào)：ab205811)。

1.2 主要儀器 WMT-100水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；RM 2235石蠟切片機(jī)(Leica公司);ChemTron KSW 光學(xué)顯微鏡(Leica公司)；RT-6500型酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司)；-80℃超低溫冰箱(SANYO公司)；電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：無(wú)特定病原體級(jí)雄性SD大鼠60只，體重(200±20) g，6～8周齡。大鼠購(gòu)自海南藥物研究所有限責(zé)任公司[動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(瓊)2020-0007]，飼養(yǎng)于20℃～25℃、相對(duì)濕度為50%～65%的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。稱大鼠體重后，將不同體重的大鼠采用隨機(jī)區(qū)組方法分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組，每組15只。

1.3.2 模型制備：采用腹腔注射氯化鋰-毛果蕓香堿建立癲癇大鼠模型[10]。取模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠，均先給予氯化鋰(127 mg/kg)腹腔注射，18～20 h后給予毛果蕓香堿(30 mg/kg)腹腔注射，注射毛果蕓香堿前30 min給予溴甲基東莨菪堿(1 mg/kg)腹腔注射以減輕膽堿能外周反應(yīng)。注射毛果蕓香堿后立即觀察各組大鼠的行為表現(xiàn)，根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]判定大鼠是否出現(xiàn)癲癇發(fā)作。其中，正常狀態(tài)為0級(jí)；面部肌肉抽動(dòng)痙攣為Ⅰ級(jí)；Ⅰ級(jí)+頸部肌肉痙攣為Ⅱ級(jí)；Ⅱ級(jí)+前肢痙攣為Ⅲ級(jí)；Ⅲ級(jí)+后肢站立為Ⅳ級(jí)；Ⅳ級(jí)+身體向后跌倒、四肢抽動(dòng)為Ⅴ級(jí)。若癲癇未發(fā)作或發(fā)作未達(dá)到Ⅳ級(jí)，則每隔30 min腹腔注射毛果蕓香堿一次(10 mg/kg)，直至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。癲癇發(fā)作達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)并持續(xù)達(dá)30 min者為造模成功。發(fā)作持續(xù)1 h后腹腔注射地西泮(10 mg/kg)以終止發(fā)作。空白組給予腹腔注射等容量生理鹽水。

1.3.3 給藥方式：造模成功后第1天，給予空白組、模型組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，將大鼠固定于ZS-B型大鼠立體定位儀，切開頭皮，暴露顱骨,以右側(cè)海馬CA3 中心區(qū)為注射靶點(diǎn)，用微量注射器給予神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠注射神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液20 μL，每隔10 d注射1次，連續(xù)注射3次；空白組、模型組于同時(shí)間注入等容量無(wú)菌生理鹽水，完成注射后留針5 min，退針后縫合頭皮。陽(yáng)性對(duì)照組給予丙戊酸鈉(400 mg/kg)腹腔注射，3次/d，連續(xù)30 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)。采用WMT-100型水迷宮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。于給藥第40天開始對(duì)各組大鼠進(jìn)行訓(xùn)練及測(cè)試。將大鼠面朝池壁，隨機(jī)從不同的4個(gè)象限入水點(diǎn)入水1次，每天訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練5 d。記錄90 s內(nèi)大鼠自入水至爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期。若入水后90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，或未爬上平臺(tái)，則將大鼠放置于平臺(tái)站立10 s后休息30～60 s，再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。記錄各組大鼠逃避潛伏期和游泳總距離。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)。于水迷宮實(shí)驗(yàn)第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各組大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶能力。撤除平臺(tái)后，將大鼠從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限的中點(diǎn)放入水中，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)、游泳總距離及在原平臺(tái)象限的探索時(shí)間。

1.4.2 血清IL-1β、IL6、TNF-α含量檢測(cè)：給藥第45天，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，給予大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，解剖大鼠后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL，3 000 r/min離心15 min取血清，分裝置于-20℃保存待測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。方法為從-20℃冰箱取出血清，常溫下放置1 h后，3 000 r/min離心15 min后取上清液檢測(cè)。樣品孔加入待檢樣品10 μL，依次加入樣品稀釋劑40 μL，相應(yīng)抗體100 μL，置于37℃孵育1 h，用試劑盒配套洗滌液洗滌5次。每孔加入底物液A、B各50 μL顯色，37℃避光孵育15 min。各反應(yīng)孔加入終止液50 μL，于酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)各孔吸光度值。

1.4.3 Nissl染色觀察海馬結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠并采集血標(biāo)本后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分別于各組隨機(jī)選取7只大鼠，開胸暴露心臟，用生理鹽水(4℃)沖洗血液，再灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液，灌注1 h后立即剝離腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定72 h，將腦組織經(jīng)冠狀面均勻切成3段，取中間含海馬段腦組織行石蠟包埋，做5 μm厚連續(xù)冠狀切片，取石蠟切片進(jìn)行Nissl染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變。

1.4.4 海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組其余8只大鼠，同法麻醉后剝離腦組織獲取大鼠海馬組織，采用免疫印跡試驗(yàn)法檢測(cè)大鼠海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表達(dá)水平。取大鼠海馬組織100～200 mg，提取總蛋白，二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度，制作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜，采用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉硝酸纖維膜2 h，一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；二抗(1 ∶5 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜，于暗室用發(fā)光液孵育膜后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采用Image J 軟件分析各條帶灰度值，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)癲癇大鼠定位航行能力的影響 水迷宮實(shí)驗(yàn)期間，與空白組大鼠相比，其他3組大鼠第1～5天的逃避潛伏期均延長(zhǎng)；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠逃避潛伏期時(shí)間均縮短(均P<0.05)，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。與空白組相比，其他3組大鼠實(shí)驗(yàn)游泳總距離均增加；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠游泳總距離縮短(均P<0.05)，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期的比較(x±s，s)

表2 各組大鼠游泳總距離的比較(x±s，cm)

2.2 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)癲癇大鼠空間探索能力的影響 水迷宮實(shí)驗(yàn)期間，與空白組大鼠相比，其他3組大鼠在原平臺(tái)象限探索有效時(shí)間比率及游泳距離比率降低，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少(均P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠在原平臺(tái)象限探索有效時(shí)間及游泳距離比率升高，穿越原平臺(tái)次數(shù)增多(均P<0.05)，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠原平臺(tái)象限探索有效時(shí)間比率、游泳距離比率、穿越平臺(tái)次數(shù)的比較(x±s)

2.3 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)癲癇大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響 與空白組大鼠比較，其他3組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高(均P<0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組血清TNF-α含量降低(P<0.05)，但兩組IL-1β、IL-6差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量比較(x±s，ng/mL)

2.4 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)的影響 Nissl染色可見，空白組大鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞密度高，排列整齊，尼氏體染色均勻，尼氏小體豐富。模型組大鼠海馬CA3 區(qū)可見神經(jīng)元損傷，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間隙擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)紊亂，尼氏體出現(xiàn)凝集，數(shù)量減少。陽(yáng)性對(duì)照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠的海馬CA3 區(qū)異常神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞排列比較規(guī)律，尼氏體數(shù)量較模型組有所增加，神經(jīng)細(xì)胞變性程度較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)(Nissl染色，×400)

2.5 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉對(duì)大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達(dá)水平的影響 與空白組相比，其他3組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表5。

圖2 各組TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達(dá)情況

表5 各組大鼠海馬組織中TLR-4-MyD88通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是由多種原因引起的腦內(nèi)神經(jīng)元反復(fù)異常放電，以反復(fù)不自主發(fā)作為主要臨床特點(diǎn)[1]。經(jīng)抗癲癇藥物治療后，目前有70%～80%的癲癇患者癲癇發(fā)作得到有效控制，但仍有20%～30%的患者治療效果不理想[4]，且臨床常規(guī)的抗癲癇藥物也存在頭暈、嗜睡、行為改變等多種不良反應(yīng)。因此，尋找療效較好且毒副作用小的抗癲癇藥物具有重要的臨床意義。

神經(jīng)節(jié)苷脂是一類從豬腦中提取的具有神經(jīng)保護(hù)作用的生物制劑，常用于腦出血、腦梗死、脊髓損傷及顱腦損傷性疾病的治療[12]。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂鈉，即神經(jīng)節(jié)苷脂鈉，是哺乳動(dòng)物腦組織中神經(jīng)節(jié)苷脂的主要種類。其能夠穿透血腦屏障，修復(fù)各種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，因而成為藥理學(xué)及臨床研究的熱點(diǎn)[5]。臨床研究表明，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液能夠有效減輕癲癇患者的癥狀，并能減少常規(guī)抗癲癇藥物引起的并發(fā)癥，在癲癇的治療上具有良好的應(yīng)用價(jià)值。例如，李小戰(zhàn)[13]的臨床研究顯示，在常規(guī)抗癲癇藥物的基礎(chǔ)上應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液能夠更有效控制癲癇發(fā)作，改善患者臨床癥狀，對(duì)腦外傷癲癇患者療效良好。此外，有研究顯示，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉還能夠有效減少癲癇患者常規(guī)抗癲癇治療相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生[14]。以上研究結(jié)果提示，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉在癲癇的治療中具有較大的潛力。但目前關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂鈉抗癲癇作用的機(jī)制如何，研究報(bào)告較少。

氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型主要表現(xiàn)為癲癇反復(fù)發(fā)作及海馬組織病理學(xué)改變，被認(rèn)為是目前最理想的癲癇動(dòng)物模型[10]。因此，本研究采用氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型，探討神經(jīng)節(jié)苷脂鈉側(cè)腦室注射對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能和神經(jīng)炎癥的作用及其機(jī)制。癲癇持續(xù)狀態(tài)反復(fù)發(fā)生可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，繼而導(dǎo)致不同程度的認(rèn)知功能障礙，主要包括記憶力減退、學(xué)習(xí)能力及智力水平下降等改變[15]?，F(xiàn)普遍認(rèn)為位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間的海馬在人的記憶功能中起著重要作用，在認(rèn)知障礙者中?？梢姷皆搮^(qū)域的病理變化[16]。海馬皮質(zhì)可劃分為CA1、CA2、CA3、CA4四個(gè)部分，其中CAl和CA3與學(xué)習(xí)、記憶以及認(rèn)知功能相關(guān)。研究表明，癲癇持續(xù)狀態(tài)可引起海馬CAl及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷，并引起海馬組織病理性改變[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期延長(zhǎng)，游泳距離增加，在原平臺(tái)象限探索有效時(shí)間比率及游泳距離比率降低，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少，表明模型組大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降及隨意運(yùn)動(dòng)障礙。癲癇模型病理改變?yōu)楹ｑR神經(jīng)元的丟失，海馬區(qū)可見存活神經(jīng)元和尼氏體含量的減少，通過(guò)Nissl染色可觀察神經(jīng)元的受損程度，本研究的Nissl染色顯示，模型組大鼠海馬CA3 區(qū)可見神經(jīng)元損傷，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間隙擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)紊亂，尼氏體出現(xiàn)凝集，數(shù)量減少，提示模型建立成功。經(jīng)側(cè)腦室注射神經(jīng)節(jié)苷脂鈉后，與模型組比較，大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)過(guò)程中逃避潛伏期及游泳距離縮短，找到平臺(tái)時(shí)間縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)增加，且神經(jīng)元損傷情況減輕，提示神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠減輕氯化鋰-毛果蕓香堿所致的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)元損傷。

盡管癲癇所致認(rèn)知障礙的機(jī)制還不十分明確，但許多學(xué)者認(rèn)為神經(jīng)炎癥反應(yīng)與其發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。癲癇發(fā)作后能夠促使局部炎性因子分泌，進(jìn)而迅速引起腦組織炎癥反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為“神經(jīng)炎癥”[18]。研究表明，神經(jīng)炎癥反應(yīng)能夠引起神經(jīng)元損傷，促使海馬區(qū)域炎癥反應(yīng)放大并分泌大量炎性因子，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[19]。有研究顯示，在癲癇動(dòng)物模型及癲癇患者腦組織中，IL-1β、 IL-6及TNF-α等促炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平均升高，提示癲癇發(fā)病可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高，提示癲癇大鼠體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)；而與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)，提示神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠減輕神經(jīng)炎癥，從而改善大鼠的認(rèn)知功能障礙。

TLR-4-MyD88信號(hào)通路與癲癇的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。TLR-4主要表達(dá)于腦組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元，可以與脂多糖、IL-1等炎癥因子結(jié)合，進(jìn)一步激活下游信號(hào)分子[21]。Maroso等[22]研究發(fā)現(xiàn)，癲癇小鼠海馬組織中TLR-4的表達(dá)增多，經(jīng)TLR-4特異性拮抗劑處理后，小鼠癲癇癥狀明顯減輕。NF-κB p65位于TLR通路的下游，與TNF-α、IL-6等多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)密切相關(guān)，是炎癥過(guò)程中炎癥介質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子[23]。MyD88是TLR-4介導(dǎo)信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，能夠促使 NF-κB p65由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；其還可以上調(diào) IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而加快癲癇的進(jìn)展[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達(dá)水平升高；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。這提示神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠有效降低大鼠海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表達(dá)以減輕神經(jīng)炎癥，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能的作用。

綜上所述，神經(jīng)節(jié)苷脂鈉能夠減輕氯化鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的神經(jīng)炎癥，并改善大鼠認(rèn)知功能障礙，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4-MyD88信號(hào)通路的激活有關(guān)。