多腺苷二磷酸核糖聚合酶1基因單核苷酸多態(tài)性與轉移性結直腸癌化療敏感性及預后的關系▲

田亞麗 趙 萬 奉 林 沈涵菁 柴曉艷 谷 敏 徐文新

(1 南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院腫瘤科，江蘇省蘇州市 215153，電子郵箱：tianyalikjc@163.com；2 江蘇省蘇州市相城區(qū)漕湖人民醫(yī)院內科，蘇州市 215131)

在所有腫瘤中，結直腸癌的發(fā)病率排第3位，病死率高居第2位，結直腸癌每年新發(fā)病例數超190萬，死亡93.5萬人，嚴重威脅人類健康[1]。在我國，不少結直腸癌患者確診時病情已經處于中晚期，甚至發(fā)生遠處轉移。轉移性結直腸癌患者常無手術根治機會，化療是其主要的治療手段，其中氟尿嘧啶類藥物聯(lián)合奧沙利鉑是轉移性結直腸癌的標準化療方案之一[2]。然而，并非所有轉移性結直腸癌患者都對化療敏感，約半數患者無法從化療中獲益，而腫瘤耐藥是導致其化療失敗的主要原因[3]。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]是核蛋白PARP家族的主要成員。PARP1是一種豐富的染色質相關蛋白，具有多種細胞功能，與DNA損傷修復、染色質重塑及轉錄調控密切相關[4]。PARP1通過檢測DNA單鏈斷裂損傷，誘導翻譯后多聚腺苷二磷酸-核糖基化來調節(jié)染色質結構，并通過向受損部位募集多種因子來參與DNA修復進程[5]。越來越多的研究表明，PARP1高表達與腫瘤細胞化療耐藥密切相關，包括腦膠質瘤[6]、肝癌[7]和卵巢癌[8]。有學者也發(fā)現在對奧沙利鉑耐藥的結腸癌細胞系HT-29-OxR中PARP1蛋白呈高表達；使用金絲桃素和麥盧卡霉素下調細胞中的PARP1水平后，耐藥細胞對奧沙利鉑的化療敏感性可恢復[9]。除此之外，最近的研究還提示PARP1高表達與卵巢癌[10]、結腸癌[11]患者的不良預后相關。

PARP1單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)能改變PARP1蛋白的結構[12]、生物學活性[13]，進而增加卵巢癌[14]、甲狀腺癌[15]、腦腫瘤[16]、結直腸癌[17]的發(fā)病風險。然而，當前PARP1的SNP與腫瘤化療反應、預后之間的關系仍不清楚，且有爭議。本研究旨在探討PARP1基因rs1136410位點T/C、 rs1805414位點T/C和rs8679位點T/C多態(tài)性對接受奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱方案化療的轉移性結直腸癌患者的化療反應及生存情況的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6月至2020年2月在南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院腫瘤科接受奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱化療的195例初治轉移性結直腸癌患者作為研究對象，均為漢族人，年齡25～80歲，中位年齡為56歲。納入標準：(1)經病理學確診為結直腸腺癌，且伴遠處轉移，無法手術根治；(2)有CT可測量評估的腫瘤病灶；(3)化療前血常規(guī)、肝腎功能、心電圖無異常；(4)預期生存時間>3個月；(5)美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)體能狀況評分<2分；(6)患者具備完全民事行為能力，且知情同意。排除標準：(1)年齡<18歲；(2)有化療禁忌證；(3)既往接受過抗腫瘤治療；(4)有腫瘤家族史；(5)存在第二原發(fā)腫瘤；(6)有精神病史。本研究嚴格按照國家人類基因組研究倫理準則開展，所有受試者均自愿參加本研究并由本人簽署知情同意書，本研究通過南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 化療方案及評價標準 受試者均接受奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱化療，具體劑量及用法： 奧沙利鉑130 mg/m2，靜脈滴注，第1天；卡培他濱1 000 mg/m2，口服，2次/d，第1～14天； 21 d為1個治療周期，每2個周期化療后行CT掃描評估療效。本研究以首次療效評估的結果進行分析，按照RECIST 1.1實體瘤療效評價標準[18]分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定和疾病進展，將完全緩解、部分緩解判定為化療敏感，疾病穩(wěn)定和疾病進展判定為化療不敏感。

1.3 DNA提取和基因型分析 首次化療前抽取肘靜脈血5 mL，采用DNA快速抽提純化試劑盒(北京普洛麥格生物技術有限公司，批號：A7280100)提取血細胞DNA，分裝后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?采用TaqMan探針法檢測基因型，PCR引物及探針序列由南京驥驁生物技術有限公司制備。PCR體系共10 μL，含DNA樣本1 μL、Mix 4 μL、上下游引物TaqMan探針各0.25 μL、上下游引物各0.25 μL、雙蒸水4 μL。PCR循環(huán)參數：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45個循環(huán)。PCR在美國Applied Biosystems公司7900HT實時熒光定量PCR儀上進行，反應過程中儀器自動收集熒光信號數據，經SDS軟件Allelic Discrimination終點分析系統(tǒng)鑒別基因型。各位點引物及探針如下， PARP1基因rs1136410：上游引物為5′-AGTACCACATCGTCAGTACT-3′，下游引物為5′-CATATGAGTCTGCAGTATGCT-3′，探針為FAM-TCATCTCGCTACTGCGACA-MGB，HEX-TACGTCTAGACTCATCACT-MGB；PARP1基因rs1805414：上游引物為5′-TACGATCTATGCGACCTGAC-3′，下游引物為5′-CGAGTTCAGTTGCTGCATC-3′，探針為FAM-CTACTCAGCTACCGACTGACC-MGB，HEX-CACGTCAGCCGATGACTCAG-MGB； PARP1基因rs8679：上游引物為5′-CTATCAGCTTCAGCTTCTCGATCT-3′，下游引物為5′-CTCTACTCACATTGTCATGCT-3′，探針為FAM-TATGCCAGTCTTACCTGCTG-MGB，HEX-ACTACTCTGAATGCAGCTGCT-MGB。

1.4 隨訪 通過電話、微信、電子郵件、信件、查詢電子病歷系統(tǒng)、登門面訪等方式對195例患者進行隨訪。從患者確診后開始隨訪，隨訪截止時間為2020年12月30日。本組患者隨訪3～42個月，中位隨訪時間為30.0個月(95%CI：26.914，33.086)。有23例患者失訪，失訪者的生存時間按照刪失數據處理。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗評估樣本的代表性。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸模型分析PARP1基因SNP與患者化療敏感性的關系，計算OR值及95%CI，并經年齡、性別、腫瘤分化程度等因素校正；采用Kaplan-Meier法計算中位生存時間并繪制生存曲線，采用log-rank檢驗比較生存曲線的差異；采用Cox回歸模型評估患者生存情況的影響因素。采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 195例轉移性結直腸癌患者的療效評估結果 195例轉移性結直腸癌患者中，完全緩解2例(1.0%)，部分緩解 75例(38.5%)，疾病穩(wěn)定58例(29.7%)，疾病進展60例(30.8%)，化療敏感率為39.5%(77/195)。不同臨床特征的患者之間的化療敏感率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 患者臨床特征與化療反應的關系[n(%)]

2.2 195例轉移性結直腸癌患者的基因型分布 195例轉移性結直腸癌患者中，PARP1基因的3個SNP均能被TaqMan探針法明確基因分型。以上3個SNP位點基因型分布均符合群體遺傳學Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)，見表2。

2.3 PARP1基因SNP與轉移性結直腸癌患者化療敏感性的關系 PARP1基因rs1136410位點基因型為TT、TC、CC的患者的化療敏感率分別為23.6%、41.8%、54.8%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.111，P=0.006)。Logistic回歸分析結果顯示，經校正相關混雜因素，PARP1基因rs1136410位點基因型與轉移性結直腸癌患者化療敏感性有關(P<0.05)，攜帶TC基因型或CC基因型的患者化療敏感性高于攜帶TT基因型的患者，見表3。

PARP1基因位點rs1805414基因型為TT、TC、CC的患者化療敏感率分別為40.0%、34.3%、51.2%，rs8679位點基因型為TT、TC、CC的患者化療敏感率分別為31.0%、40.9%、46.9%，但這兩個基因位點的SNP與轉移性結直腸癌患者的化療敏感性均無相關性(均P>0.05)，見表3。

表3 PARP1基因rs1136410、 rs1805414 和rs8679位點SNP與轉移性結直腸癌患者化療敏感性的關系[n(%)]

2.4 攜帶 PARP1基因不同基因型的轉移性結直腸癌患者的中位生存期的比較 195例轉移性結直腸癌患者總體中位生存期為17.0個月(95%CI：14.599，19.401)。PARP1基因rs1136410位點基因型為TT、TC、CC的患者的中位生存期分別為14.9個月、17.5個月、18.6個月，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.358，P=0.836)，見圖1A； rs1805414位點基因型為TT、TC、CC的患者的中位生存期分別為14.0個月、18.3個月、16.9個月，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.575，P=0.455) ，見圖1B。PARP1基因rs8679位點基因型為TT、TC、CC的患者中位生存期逐漸延長，分別為13.9個月、18.5個月、20.5個月，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.157，P=0.006)，見圖2A； 將患者分為攜帶變異基因型(TC+CC)的患者和攜帶野生純合基因型(TT)的患者，前者中位生存期為19.3個月，較后者延長(χ2=8.517，P=0.004)，見圖2B。

圖1 PARP1基因rs1136410、rs1805414位點不同基因型結直腸癌患者的生存曲線

圖2 PARP1基因rs8679位點不同基因型結直腸癌患者的生存曲線

2.5 轉移性結直腸癌患者生存情況的影響因素 由于僅攜帶PARP1基因rs8679位點不同基因型的患者中位生存期差異有統(tǒng)計學意義，將PARP1基因rs8679位點SNP作為自變量，此外，為了排除混雜因素的影響，納入年齡、飲酒史、吸煙史、腫瘤分化程度等臨床病理特征作為自變量，采用Cox比例風險回歸模型進行分析(變量賦值見表4)。結果顯示rs8679位點T/C多態(tài)性仍是患者生存情況的獨立影響因素(P<0.05)，見表5。

表4 Cox回歸分析的變量賦值

表5 Cox回歸分析結果

3 討 論

奧沙利鉑等鉑類藥物可誘導鉑-DNA加合物形成，造成NDA鉸鏈，抑制DNA的復制、轉錄，阻礙細胞周期進展，進而抑制腫瘤細胞增殖[19]。奧沙利鉑作為第三代鉑類藥物，被廣泛用于轉移性結直腸癌的治療，常與氟尿嘧啶類藥物組成聯(lián)合化療方案。然而，轉移性結直腸癌患者對化療的反應表現出明顯差異，約半數的患者對化療并不敏感，化療耐藥是轉移性結直腸癌治療失敗的主要原因，這嚴重影響患者的預后[20]。而藥敏性研究已證實DNA損傷修復能力增強是奧沙利鉑化療耐藥的主要原因[21]。PARP1基因位于第1號染色體1q41-q42，共有23個外顯子，編碼由1 014個氨基酸殘基組成的蛋白質。PARP1具有染色質重塑及轉錄調控功能[4]，并通過向受損部位募集多種修復因子來促進損傷DNA的修復[5]。研究表明，PARP1高表達與鉑類化療耐藥密切相關[8]。而在對奧沙利鉑耐藥的結腸癌細胞系HT-29-OxR中，下調PARP1的表達水平能逆轉細胞的耐藥性，使細胞恢復對奧沙利鉑的敏感性[9]。此外，還有學者發(fā)現，PARP1高表達與大腸癌患者的預后不良相關[11,22]。因此，我們推測PARP1基因多態(tài)性可能與轉移性結直腸癌患者奧沙利鉑化療敏感性及生存情況之間存在關聯(lián)。

rs1136410是PARP1基因最常見的非同義多態(tài)性位點，位于人類聚二磷酸核糖聚合酶催化結構域的762密碼子位置，堿基T變異為C后導致編碼的纈氨酸(Val)轉換為丙氨酸(Ala)，引起蛋白質結構改變，進而影響PARP1的生物學功能[16]。研究顯示，PARP1基因rs1136410位點SNP與癌癥的發(fā)病風險有關。例如，rs1136410位點變異等位基因C與口腔鱗癌的發(fā)病風險增高密切相關(OR=1.909，P=0.029)[23]；rs1136410位點野生純合基因型CC還與甲狀腺癌易感性增加顯著相關(OR=1.30，P=0.05)[15]；一項Meta分析也提示，與TT和TC基因型相比，rs1136410位點CC基因型可增加胃癌、甲狀腺癌和宮頸癌等腫瘤的發(fā)病風險[24]。此外，PARP1基因rs1136410位點SNP與癌癥患者的預后也密切相關。Zhou等[25]對食管小細胞癌患者進行研究，發(fā)現攜帶rs1136410位點變異基因型(TC+CC)患者的中位生存期長于攜帶野生純合基因型(TT)的患者(分別為17.4個月、14.8個月，P=0.032)。相反，在接受順鉑同步放化療的早期宮頸癌患者中，攜帶rs1136410位點C等位基因的圍絕經期和絕經后婦女的總體生存期和無疾病進展生存期明顯縮短(P=0.008、0.006)[26]。更重要的是，還有研究顯示，攜帶rs1136410位點CC基因型卵巢癌的患者對鉑類藥物化療敏感，其對鉑類耐藥的風險低于TT基因型患者(校正OR=0.40，P=0.001)[27]。本研究也發(fā)現了類似的結果，PARP1基因rs1136410位點基因型與轉移性結直腸癌患者的化療敏感性有關(P<0.05)，攜帶TC基因型或CC基因型的患者的化療敏感性分別為攜帶TT基因型患者的2.415倍、4.488倍。我們推測這可能是因為rs1136410位點變異等位基因(C)引起編碼氨基酸殘基替換為丙氨酸，改變了PARP1蛋白的結構，影響其正常的生物學活性，進而減弱DNA修復能力，最終提升奧沙利鉑化療的敏感性。當然，這些推論還需要更多的SNP功能學研究來證實。盡管攜帶rs1136410位點TC基因型或CC基因型的結直腸癌患者對化療更敏感，但這部分患者的化療獲益并未轉換為生存獲益，在本研究中我們未發(fā)現rs1136410位點SNP與轉移性結直腸癌患者的生存時間之間存在關聯(lián)(P>0.05)。我們分析其原因如下：化療的近期療效對腫瘤無進展生存時間影響較大，而與總生存時間的關聯(lián)可能相對較小。本研究只針對一線化療的療效進行評價，而部分患者在一線化療失敗后拒絕二線治療，即使患者接受二線、三線治療，其方案也不盡相同，且治療順序也存在差異，導致一線化療的獲益無法延長總生存時間。此前尚未見rs1136410位點SNP與結直腸癌患者生存時間的研究報告，該位點SNP與結直腸癌患者臨床預后之間的關系仍需要更多的研究深入探討。

rs1805414 T/C位于PARP1基因第7外顯子，參與編碼PADR-1結構域內的第284位氨基酸殘基(Ala284Ala)，屬于同義SNP。一項病例對照研究顯示，rs1805414 T/C多態(tài)性與巴基斯坦人群腦腫瘤的發(fā)病風險相關，患者的雜合基因型(TC)頻率明顯低于對照組(OR=0.77，P=0.05)[16]。相反，在沙特阿拉伯人群中，rs1805414變異等位基因C攜帶者(包括TC、CC基因型)發(fā)生乳腺癌的風險顯著增高[28]。此外，還有研究發(fā)現rs1805414 T/C位點SNP與其他位點rs1136410 T/C、 rs1805404 C/T SNP組成的單體型能影響甲狀腺癌的發(fā)生風險[15]。然而，在本研究中我們并未發(fā)現rs1805414 T/C多態(tài)性與轉移性結直腸癌患者化療反應及生存情況之間存在關聯(lián)(P>0.05)，且此前也未見有研究報告該位點多態(tài)性與腫瘤化療效果之間的關系，rs1805414 T/C多態(tài)性與腫瘤化療預后之間的關系仍不清晰，需進一步深入研究。

rs8679 T/C位于PARP1基因3′非翻譯區(qū)中微小RNA結合位點，可能通過影響微小RNA與mRNA的結合而改變PARP1的表達水平[17]。一項雙中心病例對照研究顯示， rs8679位點多態(tài)性與卵巢癌的發(fā)病風險密切相關[14]。此外，還有研究顯示rs8679 T/C多態(tài)性能影響結直腸癌的易感性，攜帶變異等位基因C者罹患結直腸癌的風險明顯降低[17,22]。但是，在中國磁縣人群中，并未發(fā)現rs8679 T/C多態(tài)性與食管鱗癌的發(fā)病風險存在明顯關聯(lián)[29]。此前，有一項研究探討了rs8679 T/C多態(tài)性與卵巢癌化療療效的關系，但未發(fā)現該多態(tài)性與鉑類化療敏感性及臨床預后相關[27]。本研究結果顯示，rs8679位點多態(tài)性與轉移性結直腸癌患者的生存情況相關，rs8679位點基因型為TT、TC、CC患者的中位生存期分別為13.9個月、18.5個月、20.5個月，呈逐漸延長的趨勢(P<0.05)； 攜帶變異基因型(TC+CC)患者的中位生存期為19.3個月，較攜帶野生純合基因型TT的患者顯著延長(P<0.05)。然而，在捷克人群中，攜帶rs8679位點CC基因型的結直腸癌患者在接受5-氟尿嘧啶為基礎的化療后復發(fā)或進展的風險增加(P=0.03)[20]。這與我們的研究結論存在差異，考慮與研究對象的種族、腫瘤分期、入排標準、治療方案不同有關。此外，本研究結果顯示，攜帶rs8679位點TT、TC、CC基因型的患者化療敏感率分別為31.0%、40.9%、46.9%，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，考慮與本研究樣本量總體偏少，影響了統(tǒng)計學檢驗效能有關。因此，需進一步開展更大樣本的研究來探討rs8679位點基因多態(tài)性與結直腸癌化療過敏性之間的關系。

綜上所述，PARP1基因多態(tài)性與轉移性結直腸癌患者化療反應及臨床預后相關，其中攜帶rs1136410位點 C等位基因者對奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱化療更加敏感，而攜帶rs8679位點C等位基因攜帶者在奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱化療后可獲得更長的生存期。本研究結果可能在評估轉移性結直腸癌化療敏感性及生存預后方面有一定的指導作用。