微塑料和芘對菲律賓蛤仔的毒性效應研究

柳佳佳，朱效鵬，滕佳，趙建民，李成華，單恩翠，張晨，王清

（1.寧波大學，浙江 寧波 315211；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物資源高效利用研究與發(fā)展中心，山東 煙臺 264003；3.中國科學院煙臺海岸帶研究所 牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站，山東 煙臺 264117；4.中國科學院大學，北京 100049）

塑料制品由于輕便、耐用和價廉等特點被廣泛應用于農業(yè)、工業(yè)及日常生活中。2019 年，全球塑料產量達到3.7 億噸（Plastics Europe，2020）。每年塑料產量的50%用于制作一次性塑料產品，預計會產生大量的塑料垃圾（Plastics Europe，2020）。據(jù)估計，每年約有480 萬～1 270 萬噸塑料垃圾進入海洋（Jambeck et al，2015）。目前世界大部分海域的水體、沉積物以及海洋生物體內均已檢測到微塑料（冉文 等，2018；Farrell et al，2013；Cincinelli et al，2017；Smith et al，2018；He et al，2021；Russell et al，2021）。越來越多的研究證實了微塑料對海洋動物的多種毒性效應，包括能量儲備減少、攝食能力受抑制、炎癥反應和代謝紊亂等（Van Cauwenberghe et al，2012；Von Moos et al，2012；Lu et al，2016；Watts et al，2016；Cole et al，2019）。富集在生物體內的微塑料能夠沿食物鏈進行傳遞，危害生態(tài)系統(tǒng)，甚至對人類健康產生負面影響（Farrell et al，2013）。微塑料還會從環(huán)境中吸附重金屬和有機污染物，從而成為有毒有害化學物質的載體（Browne et al，2013）。因此，微塑料已成為海洋環(huán)境中廣泛存在的一類污染物，引起了世界各國特別是沿海國家的高度重視。

多環(huán)芳烴類化合物（PAHs）因其具有生物蓄積性、高毒性、長期殘留性、半揮發(fā)性和可長距離運輸性在國際上備受關注。PAHs 主要來源包括森林火災、石油泄漏以及礦物燃料等的不完全燃燒（Sun et al，2012）。近年來，研究人員在海水、河流、沉積物和海洋生物體中均已檢測到PAHs 的存在（Zhi et al，2015；Nemr et al，2016；Jafarabadi et al，2017；Wang et al，2019；Liu et al，2021；Pichler et al，2021；Yuan et al，2021）。海洋環(huán)境中的PAHs 主要通過海洋生物的攝食以及皮膚滲透等途徑進入生物體中，其對海洋生物構成的威脅不容忽視（Collier et al，2013；Pulster et al，2021）。例如，苯并（a）芘（BaP）能通過激活MAPKs 從而抑制櫛孔扇貝（Chlamys farreri） 血細胞的免疫防御能力（劉靜，2009）。Wessel 等（2007）調查發(fā)現(xiàn)，BaP、琢-乙炔基雌二醇和硫丹暴露對長牡蠣（Crassostrea gigas）具有胚胎發(fā)育毒性和遺傳毒性，且胚胎畸形率和DNA 損傷水平具有明顯的相關性。

PAHs 具有較高的親脂性，與水相比，微塑料的疏水表面使其更容易濃縮PAHs，并且二者對生物的脅迫作用可能會相互影響（Teuten et al，2009；Gouin et al，2011；Koelmans et al，2016）。研究表明，小眼長臂鰕虎魚（Pomatoschistus microps）暴露于吸附芘的微塑料96 h，其代謝酶活力被抑制，免疫力下降（Oliveira et al，2013）。當貽貝（Mytilus spp.）暴露于聚苯乙烯中（含或不含熒蒽）時，聯(lián)合暴露組貽貝組織病理學損傷和抗氧化標記物水平最高（Paul-Pont et al，2016）。研究表明，與單獨暴露于微塑料的斑馬魚（Danio rerio）相比，多氯聯(lián)苯、溴化阻燃劑和甲基汞等污染物共存會導致斑馬魚肝和腦中的生物標志物基因過表達，器官穩(wěn)態(tài)顯著改變（Rainieri et al，2018）。Tang 等（2020）發(fā)現(xiàn)微塑料的存在提高了雙酚A 對泥蚶（Tegillarca granosa）的免疫毒性和神經毒性。由此可見，微塑料和PAHs 聯(lián)合作用可能會對海洋生物產生更大的毒性效應，因此，亟待開展微塑料與PAHs 的聯(lián)合毒性效應研究。

菲律賓蛤仔是沿海灘涂重要的經濟貝類，在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。菲律賓蛤仔是濾食動物，生命周期長，對鹽度和溫度的高波動具有耐受性，對污染物具有高蓄積能力，符合作為生物指示物 種的 標 準（Tanguy et al，2008；Sacchi et al，2013）。有研究報道，菲律賓蛤仔能從其生活環(huán)境中攝取并積累大量的微塑料（Davidson et al，2016；Cho et al，2019）。但迄今為止，關于微塑料的毒性研究大多集中于牡蠣和貽貝（Von Moos et al，2012；Avio et al，2015；Sussarellu et al，2016；Ribeiro et al，2017；Teng et al，2021）。因此，在本研究中，我們探討了兩種不同粒徑聚苯乙烯微球和芘單一及聯(lián)合暴露（21 d）對菲律賓蛤仔的毒性效應，在個體（如肥滿度和攝食率）、組織（如氧化應激和脂質過氧化水平）和細胞（如血淋巴免疫調節(jié)）水平探討兩種污染物對菲律賓蛤仔的毒性效應。同時，運用綜合生物標志物響應指數(shù)法（IBR）評價了微塑料和芘對菲律賓蛤仔的毒性作用，以期為微塑料和有機污染物的生態(tài)風險評估以及國家制定相關應對策略與政策提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在山東省煙臺沿海（36毅16憶N—38毅23憶N，119毅34憶E—121毅57憶E） 采集了1200 只殼形完整、大小相近的野生菲律賓蛤仔（殼長3.5依1.0 cm，殼高2.6 依0.8 cm，n= 30），在實驗室用過濾海水洗凈。菲律賓蛤仔置于玻璃罐（60 cm伊60 cm伊100 cm）中，暫養(yǎng)14 d。在暫養(yǎng)期內，每天更新所有海水并連續(xù)充氣，投喂螺旋藻溶液，濃度為4.3 伊107cells/mL。每天使用YSI 設備（YSI 型號85，Yellow Springs，OH，USA）測定所有玻璃缸中的水質參數(shù)，水溫為19.6 依0.3 益，pH 為8.1 依0.1，鹽度為31.8 依0.4。

聚苯乙烯微球原料分散體是乳濁液（2.5%w/v，10 mL），含有0.05%的NaN3，購自天津倍思樂中心，通過掃描電子顯微鏡（SEM）（S-4800，Hitachi）檢查聚苯乙烯的尺寸和形貌（圖1）。其直徑為0.34 依0.008 滋m 和6.34 依0.087 滋m。芘（CAS：129-00-0）購自薩恩化學技術有限公司，由于芘在水中的溶解度低，因此，在二甲亞砜（DMSO，MP Biomedicals，USA）中制備芘的儲備溶液。各芘處理組的溶劑DMSO 濃度均保持在0.001%，預計該濃度不會對菲律賓蛤仔產生不利影響（Venier et al，1997；Zhang et al，2019）。已有研究表明，吸附BaP的聚苯乙烯暴露對紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）的毒性要高于單獨聚苯乙烯暴露；與大尺寸聚苯乙烯（4.5 滋m）相比，小尺寸聚苯乙烯（0.5 滋m）對紫貽貝具有更高的毒性（Gonz佗lez-Soto et al，2019）。因此，為探討不同尺寸微塑料對菲律賓蛤仔的毒性效應及差異，本研究選擇微米級（6 滋m）和納米級（0.3 滋m）兩種尺寸聚苯乙烯微塑料開展暴露試驗。

圖1 掃描電子顯微鏡（SEM）表征聚苯乙烯微塑料

1.2 實驗設計

本實驗設置4 個單一暴露處理組，包括兩種尺寸的聚苯乙烯（0.3滋m（SMPs）和6滋m（BMPs））和兩個濃度的芘溶液（10 滋g/L（L-pyrene）和100 滋g/L（H-pyrene））。在單一暴露組的基礎上設置2 伊2 雙因素設計，共計4 個聯(lián)合暴露處理組（SMPs+Lpyrene、SMPs+H-pyrene、BMPs+L-pyrene、BMPs+H-pyrene）。同時設置潔凈海水和溶劑（DMSO）對照組。實驗中設置的芘暴露濃度10 滋g/L 為環(huán)境相關濃度（Zhang et al，2019），高濃度100 滋g/L是為了探究芘對貝類的毒性效應，并且已有室內研究報道了類似濃度會對生物體產生毒性效應（Tang et al，2020）。微塑料暴露濃度設置為20 滋g/L，該濃度高于現(xiàn)實環(huán)境濃度，但預測未來在部分海域可能會出現(xiàn)（Everaert et al，2018），相關研究也表明類似暴露濃度會對一些海洋生物產生毒性效應（Oliveira et al，2013；Skdokur et al，2020）。

微塑料的原液懸浮液在去離子水中配制，濃度為0.25 g/L 并在使用前進行超聲波處理。芘溶液采用DMSO 配制成質量為10 mg/L 的母液，根據(jù)實驗需要用過濾海水進行稀釋。每個玻璃缸養(yǎng)殖60 只實驗動物（100 L）。實驗期間養(yǎng)殖條件與適應期一致，每天定時投餌，更換海水，換水后重新添加芘和微塑料至設定濃度。每天重投暴露介質后2 h 內不投喂螺旋藻，以避免藻類與塑料顆粒之間發(fā)生相互作用（Teng et al，2021；Wang et al，2021）。此外，注意調節(jié)氣石的位置和曝氣強度，使暴露介質和餌料在海水中分布相對均勻。

1.3 生理指標測定

各暴露組隨機選取8 只菲律賓蛤仔，解剖后將殼和全部軟組織置于60 益烘箱烘至恒重。計算樣品干肉重與干殼重的比例（FW/SW 伊100%）來獲得菲律賓蛤仔的肥滿度指數(shù)（Condition Index，CI）。

根據(jù)Coughlan（1969）之前所述的方法測定攝食率（Clearance Rate，CR）。每組20 只菲律賓蛤仔轉移到100 L 海水的玻璃缸暫養(yǎng)1 h，然后加入初始濃度為4.3 伊107cells/mL 的螺旋藻液。期間連續(xù)充氣，使藻液在海水中分布相對均勻。測定開始時，在玻璃缸中取20 mL 水樣進行分析，隨后分別在30 min、60 min、90 min 和120 min 采集水樣。使用數(shù)字流式細胞攝像系統(tǒng)（VS-IV，F(xiàn)luid Imaging Technology，USA） 測定藻類細胞濃度。CR 通過以下公式計算：

CR=V 伊（lnC0-lnCt）/N 伊t

其中，CR 是攝食率（L/h），災是測試容器中海水的體積（蘊），C0是初始藻細胞濃度（cells/mL），Ct是賊時間后藻細胞濃度（cells/mL），暈為容器中菲律賓蛤仔數(shù)量，賊是實驗時間（h）。

1.4 血細胞免疫指標測定

實驗結束后，用無菌注射器抽取1.5 mL 血淋巴細胞，用雙層300 目篩絹過濾到Eppendorf 離心管，迅速與等體積預冷的抗凝劑混合，以防止血細胞聚集。各組樣品分裝兩份，分別用于菲律賓蛤仔血淋巴細胞凋亡率和吞噬活性的測定。利用臺式高速冷凍離心機（5804R，Eppendorf，Germany） 進行預處理。將分裝好的血淋巴在2000 g 條件下離心10 min，棄去上清，加入1 mL PBS 緩沖液重懸血淋巴，重復重懸一次。加入各指標相應的緩沖液來進行相關指標的檢測。

血淋巴細胞凋亡率測定方法簡述如下：使用500 滋L 緩沖液重懸血淋巴細胞。按照試劑盒（Annexin V-FITC/PI，上海碧云天生物技術有限公司）說明，先加入5 滋L Annexin V-FITC，18 益避光孵育5 min，再加入5 滋L PI，18益避光孵育5 min。對經過上述處理后的樣品用流式細胞儀（FACSAriaTM，Becton，Dickinson and Company）進行分析（FL-1 通道檢測Annexin V-FITC 綠色熒光，F(xiàn)L-2 通道檢測PI 紅色熒光）。各樣品中血淋巴細胞凋亡率的結果用FITC 陽性和PI 陰性細胞數(shù)目占總細胞數(shù)目的百分比來表示。

血淋巴細胞吞噬活性測定方法簡述如下：用500 滋L PBS 重懸血細胞，加入PBS 稀釋成2.3%的熒光微球（YG 2.0 微米，Polysciences，Germany），使其終濃度為0.3%，18 益避光孵育1 h 后加入400 滋L 6%的福爾馬林溶液中止反應，并用流式細胞儀分析（微球綠色熒光用FL-1 通道檢測）。血細胞吞噬活性用吞噬3 個或3 個以上微球的血細胞數(shù)目占血細胞總數(shù)的百分比來表示。

1.5 氧化應激指標測定

暴露結束后，分別稱取菲律賓蛤仔的消化腺和鰓組織各0.1 g 左右。按照1 頤10（w/v）的比例加入勻漿介質。使用IKA 勻漿機（T10 Ultra Turrax basic，IKA，Germany）完全均質化（6000 r/min 勻漿4 次，每次20 s）。待勻漿液冷卻后，在4 益，10 000 g 下離心15 min，收集上清液即為10%組織勻漿。菲律賓蛤仔組織內丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S-transferase，GST）活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒中描述的方法進行測定。組織總蛋白濃度采用BCA 法測定，參照碧云天生物公司相關試劑盒進行，單位為mg/L?？寡趸富钚缘幕盍挝粸閁/mg 蛋白。脂質過氧化水平以組織內的MDA 含量表示，單位為nmol MDA/mg 蛋白。

1.6 綜合生物標志物分析

為了將鰓和消化腺組織所有測量到的生物標志物反應整合到一個通用的“應激指標”中，按照Sanchez 等（2013）建立的綜合生物標志物分析法（Integrated Biomarker Response，IBR），評價微塑料和芘單一及聯(lián)合暴露對菲律賓蛤仔的毒性效應。該方法根據(jù)Belieff 等（2002）介紹的IBR 指數(shù)法基礎上改進而來。

1.7 統(tǒng)計分析

結果顯示為平均值依標準偏差。分別使用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗對所有數(shù)據(jù)進行方差的正態(tài)性和齊性檢驗。使用單因素方差分析（ANOVA）評估所有暴露組中生物學參數(shù)的統(tǒng)計學差異。當方差的正態(tài)性和齊性不滿足時，使用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗和Mann-Whitney U 檢驗來分析數(shù)據(jù)。顯著性水平設定為0.05。使用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計分析。

2 研究結果

2.1 生理指標

研究發(fā)現(xiàn)，除了聯(lián)合暴露組（SMPs+H-pyrene）外，其余暴露組菲律賓蛤仔的CI 與對照組相比沒有顯著差異，并且SMPs+H-pyrene 暴露組菲律賓蛤仔的CI 顯著高于H-pyrene 暴露組（p <0.05）。單一微塑料暴露組CR 顯著低于對照組（p <0.05），但與聯(lián)合暴露組相比沒有顯著差異。聯(lián)合暴露組CR 低于單一芘暴露組，說明微塑料的存在增加了芘的毒性效應（圖2）。

圖2 微塑料和芘暴露對菲律賓蛤仔生理指標（a：肥滿度；b：攝食率）的影響

2.2 免疫指標

微塑料和芘暴露后，菲律賓蛤仔血細胞免疫指標結果如圖3 所示。各暴露組血細胞凋亡率均高于對照組，其中，在SMPs 和高濃度芘存在的條件下，血細胞凋亡率較對照組水平顯著增加了6.93%（p <0.05），并且二者聯(lián)合暴露組血細胞凋亡率最高。在單一芘暴露組，細胞凋亡率隨芘劑量的增加從10.94%增加到14.45%。對血細胞吞噬活性而言，各暴露組吞噬活性均低于對照組，其中，除BMPs 暴露組外，其他各暴露組較對照組水平均有顯著變化（p <0.05）。

圖3 微塑料和芘暴露對菲律賓蛤仔血細胞免疫相關指標（a：細胞凋亡率；b：細胞吞噬活性）的影響

2.3 抗氧化反應

微塑料和芘單一及聯(lián)合暴露對菲律賓蛤仔鰓和消化腺組織抗氧化酶和脂質過氧化水平的影響如圖4所示。SMPs 和SMPs+H-pyrene 暴露組菲律賓蛤仔鰓組織MDA 含量較對照組水平分別顯著增加0.37和0.44 mmol/mg 蛋白（p <0.05）；SMPs 暴露組鰓組織MDA 含量較BMPs 組含量增加0.32 mmol/mg蛋白（p <0.05）；SMPs 和兩種濃度芘聯(lián)合暴露組菲律賓蛤仔消化腺組織MDA 含量較對照組水平分別顯著增加0.61 和0.57 mmol/mg 蛋白（p <0.05）。SMPs 和微塑料+L-pyrene 暴露組菲律賓蛤仔鰓組織CAT 活性顯著高于對照組（p <0.05）；在消化腺組織中，單一芘暴露組的CAT 活性顯著高于對照組（p < 0.05） 且聯(lián)合暴露組的CAT 活性低于單一暴露組。菲律賓蛤仔鰓組織SOD 活性與對照組相比無顯著差異；微塑料+H-pyrene 聯(lián)合暴露組的消化腺SOD 活性較對照組顯著降低12.17 U/mg 蛋白和9.59 U/mg 蛋白（p <0.05）。聯(lián)合暴露組和H-pyrene 單一暴露組鰓組織GST 活性均顯著低于對照組（p <0.05）；在消化腺組織中，聯(lián)合暴露組和單一芘暴露組GST 活性顯著高于對照組（p<0.05）。

圖4 微塑料和芘暴露對菲律賓蛤仔鰓和消化腺中的抗氧化酶活性和脂質過氧化水平的影響

2.4 綜合生物標志物指數(shù)

采用綜合生物標志物指數(shù)法，對菲律賓蛤仔鰓和消化腺組織的抗氧化酶活性和脂質過氧化水平生物標志物的響應值進行分析。結果如圖5 所示，在鰓組織中，聯(lián)合暴露組和單一芘暴露組的GST 活性變化幅度最大，微塑料單一暴露組的MDA 含量變化幅度最大。而在消化腺組織中，聯(lián)合暴露組和微塑料單一暴露組的MDA 含量變化幅度最大，低濃度芘單一暴露組的CAT 活性變化幅度最大，高濃度芘單一暴露組中的GST 活性變化幅度最大。所有暴露組的IBR 值較對照組水平均有所升高，其中SMPs 單一暴露組最高。微塑料和芘聯(lián)合暴露能夠引起比單一壓力源（芘和BMPs）更高的IBR值。根據(jù)IBR 值計算結果，微塑料和芘對消化腺組織的總體影響高于鰓組織。

圖5 微塑料和芘暴露后菲律賓蛤仔生物標志物星狀圖和綜合生物標記物響應指數(shù)

3 討論

3.1 生理指標

肥滿度指數(shù)（CI）作為生物體健康狀況的指標，可以直接用于評估環(huán)境壓力（Tejeda-Vera et al，2007；Luna-Acosta et al，2017）。在本研究中，除了高濃度芘暴露組，其余暴露組菲律賓蛤仔CI與對照組相比都沒有顯著差異。同樣，Gonz佗lez-Soto 等（2019）發(fā)現(xiàn)暴露于聚苯乙烯和BaP（7 d和26 d）的貽貝（M.galloprovincialis）CI 與對照組相比沒有顯著差異。此外，蛤類（Scrobicularia plana）暴露于1 mg/L 粒徑為20 滋m 的聚苯乙烯14 d，其CI 也沒有發(fā)生顯著變化（Ribeiro et al，2017）。聯(lián)合暴露組（SMPs+H-pyrene）菲律賓蛤仔CI 顯著高于H-pyrene 暴露組，說明芘對菲律賓蛤仔CI 的影響大于微塑料。如圖2（b）所示，SMPs+H-pyrene暴露組CR 低于H-pyrene 暴露組，這可能是由于復合暴露組菲律賓蛤仔攝入吸附芘的微塑料較少，從而導致其CI 高于H-pyrene 暴露組。

微塑料單一或聯(lián)合暴露都顯著抑制了菲律賓蛤仔的攝食率（CR）。前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著聚氯乙烯微塑料暴露濃度的增加，貽貝（Mytilus edulis）的CR 降低（Rist et al，2016）。雙殼類有較強的濾水能力，因此，其鰓組織易受到海水中污染物的影響。一方面，雙殼類會根據(jù)環(huán)境中食物顆粒的數(shù)量和水質來調節(jié)瓣膜的開度，CR 的大幅度降低可能是因為微塑料顆粒引起菲律賓蛤仔鰓瓣膜關閉；另一方面，微塑料可能通過損傷上皮細胞或引起堵塞而對生物造成潛在的傷害，從而導致CR 被抑制（Bacon et al，1998）。本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露組菲律賓蛤仔的CR 低于單一暴露組，表明微塑料和苯并芘聯(lián)合脅迫效應更為明顯。有研究表明，比起單獨暴露于微塑料和鉻，兩種污染物聯(lián)合暴露下，小眼長臀鰕虎（Pomatoschistus microps）幼魚捕食性能顯著下降（Lu侏s et al，2015）。Green 等（2017）發(fā)現(xiàn)暴露于25 滋g/L 的聚乳酸或高密度聚乙烯微塑料的貽貝（M. edulis） CR 下降，但牡蠣（Ostrea edulis）的CR 增加。不同的暴露時間、微塑料和污染物類型以及生物生活方式可能會導致研究結果的差異。因此，需要開展更多的研究，以確定相關的研究結果是否在雙殼類動物中普遍適用。

3.2 血淋巴免疫指標

在本研究中，微塑料和芘單獨或聯(lián)合暴露均能誘導菲律賓蛤仔血細胞凋亡率的增加，并且聯(lián)合暴露組血細胞凋亡率高于單一暴露組，表明聯(lián)合暴露下菲律賓蛤仔免疫系統(tǒng)受到的損害更為嚴重。與本研究結果類似，經聚苯乙烯微塑料和多溴聯(lián)苯醚暴露后，櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血細胞細胞凋亡率增加，并且微塑料會增強多溴聯(lián)苯醚對櫛孔扇貝（C.farreri）的免疫毒性（滕瑤，2018）。Sendra 等（2020）研究聚苯乙烯對紫貽貝（M.galloprovincialis）不同血細胞亞群的免疫毒性，發(fā)現(xiàn)微塑料暴露導致凋亡信號增加以及吞噬活性降低。本研究結果顯示，SMPs 暴露組細胞凋亡率高于BMPs 暴露組。Browne 等（2008）研究發(fā)現(xiàn)小于9.6 滋m 的聚苯乙烯顆?？蓮馁O貝（M.edulis）腸道轉移到血細胞內；顆粒大小影響聚苯乙烯的轉移能力，在體腔液中，較小的（3.0 滋m）顆粒比較大的（9.6 滋m）顆粒多60%。因此，SMPs 暴露組細胞凋亡率增加可能是小粒徑（0.3 滋m）微塑料在血細胞大量積累所致。

在貝類免疫反應中，吞噬作用是貝類血細胞的主要防御手段，當異物和病原體入侵機體的時候，血細胞主要通過吞噬過程清除外來物（吳芳麗等，2016）。微塑料和芘單獨或聯(lián)合暴露對菲律賓蛤仔血細胞的吞噬活性有抑制作用，與相應劑量的微塑料和芘單獨暴露相比，聯(lián)合暴露可降低菲律賓蛤仔的吞噬活性，說明這兩種污染物對菲律賓蛤仔具有明顯的免疫毒性。聚苯乙烯被證實會影響紫貽貝（M. galloprovincialis） 血細胞溶酶體膜的穩(wěn)定性（Canesi et al，2015），從而抑制吞噬作用（Sun et al，2017；Su et al，2018）。李佳娜（2019） 發(fā)現(xiàn)微塑料暴露組血細胞吞噬活性都低于對照組，但沒有顯著性差異，僅有雌二醇和微塑料聯(lián)合暴露組血細胞吞噬活性顯著低于對照組，預示著兩種污染物的聯(lián)合暴露會導致毒性增強。Tang 等（2020） 也發(fā)現(xiàn)暴露于微塑料和雙酚A 的泥蚶（T. granosa）體內血細胞總數(shù)減少，顆粒細胞比例下降并且細胞類型組成改變。顆粒細胞是最具吞噬活性的血細胞（Liu et al，2016），因此，聯(lián)合暴露組泥蚶血細胞吞噬活性被顯著抑制。前期研究也表明，雙殼貝類暴露于污染物（如微塑料）可能會導致血細胞數(shù)量減少（Von Moos et al，2012；Tang et al，2020）。本研究中菲律賓蛤仔血細胞凋亡率的增加可能會導致血細胞數(shù)量的降低，具有吞噬功能的細胞數(shù)量降低可能會引起血細胞吞噬率降低。因此，暴露組菲律賓蛤仔血細胞凋亡率升高可能是吞噬活性降低的原因之一。濃度也是污染物對生物體產生毒性效應的重要影響因素。在芘單獨暴露組中，血細胞吞噬活性隨芘劑量的增加而降低，表明芘可能以劑量依賴的方式引起血細胞免疫反應的變化。Croxton 等（2012）研究發(fā)現(xiàn)5 滋g/L 芘和BaP 均能輕微誘導牡蠣（Crassostrea virginica）血細胞的吞噬活性增加，但隨著濃度的增加，吞噬活性降低。貽貝（M.edulis）暴露于PAHs 濃度為500 滋g/L 的餌料兩周后，其血細胞吞噬能力顯著降低（Grundy et al，1996）。

3.3 抗氧化酶活性和脂質過氧化水平

當機體受到外界環(huán)境脅迫時，通常會誘導產生過量的活性氧（ROS）。ROS 的過量產生能夠導致蛋白質、DNA 和膜脂質發(fā)生氧化損傷，并伴隨著脂質過氧化程度加?。℉emnani et al，1998；Winterbourn et al，2008；Lushchak et al，2011）。生物體內存在復雜的抗氧化系統(tǒng)，主要包括酶類抗氧化劑（SOD、CAT、GST 等）和低分子量的活性氧清除分子，以保護機體免受活性氧的損傷。因此，測定清除ROS 的抗氧化酶活性和脂質過氧化水平，可以評估生物體受到氧化脅迫的程度（Hu et al，2015；Velez et al，2016；Zhang et al，2016；Coppola et al，2017）。

MDA 是脂質過氧化的終產物，生物體內的MDA 含量可以反映海洋生物體內氧化損傷程度（Damiens et al， 2007； Tomanek et al， 2011；Ferreira et al，2019）。在本研究中，所有脅迫暴露組的MDA 含量均高于對照組水平。產生上述結果的原因是生物體的抗氧化防御機制不足以保護機體免受氧化應激脅迫，從而導致了機體產生更高水平的脂質過氧化。研究表明，微塑料和污染物均能導致海洋生物體內出現(xiàn)嚴重的氧化損傷（Vlahogianni et al，2007；于慶云 等，2013；Yu et al，2018）。本研究中SMPs 暴露組鰓組織MDA 含量顯著高于BMPs 暴露組，表明小粒徑微塑料對菲律賓蛤仔的氧化損傷程度大于大粒徑微塑料，這可能是由于小粒徑微塑料更容易在生物組織內富集所導致（Deng et al，2017；Hariharan et al，2021；Wright et al，2013）。除了SMPs 暴露組，鰓組織的BMPs 和芘聯(lián)合暴露組MDA 含量均高于單一暴露組。Sheng等（2021）研究也發(fā)現(xiàn)，暴露于微塑料和三氯生的斑馬魚體內也檢測到脂質過氧化，并且二者對肝臟MDA 含量的聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加效應。

通常情況下，SOD 和CAT 是抗氧化防御系統(tǒng)的第一條防線，用以清除生物體內因污染脅迫產生的ROS（Miller et al，2008）。SOD 可以催化超氧自由基（·O2-） 轉化為過氧化氫（H2O2） 和分子氧（O2），然后CAT 可以催化H2O2分解產生氧氣（O2）和水（H2O） （Lesser et al，2006）。GST 具有清除體內自由基及解毒的雙重功能，能夠催化谷胱甘肽與進入體內的外源性物質相結合，最終促使這類物質排出生物體（Sheehan et al，2001）。微塑料和芘暴露對菲律賓蛤仔體內不同抗氧化酶的影響具有一定差異性。在鰓組織中，微塑料單獨或和芘聯(lián)合暴露導致CAT 活性升高。與之類似，Magara 等（2018） 發(fā)現(xiàn)微塑料暴露會影響貽貝（M. edulis）鰓的氧化應激系統(tǒng)，使CAT 活性增加。本研究中單一暴露組鰓組織中SOD 活性低于微塑料和芘聯(lián)合暴露組，表明當兩種污染物同時存在時，鰓組織氧化應激反應增強。SOD 和CAT 活性上升可能是由于污染物在菲律賓蛤仔體內的代謝過程中出現(xiàn)過多自由基，組織反饋性增強抗氧化系統(tǒng)酶活性，以清除多余的自由基。Magara 等（2019）發(fā)現(xiàn)，微塑料和熒蒽暴露后貽貝（M.edulis）鰓組織SOD 活性變化和本研究呈現(xiàn)相同的變化趨勢。Webb 等（2020）發(fā)現(xiàn)貽貝（Perna canaliculus）暴露于添加三氯生的微塑料時，其鰓組織SOD 活性升高。在聯(lián)合暴露下，菲律賓蛤仔鰓組織GST 活性被抑制，而除H-pyrene 處理組，其余單一暴露組菲律賓蛤仔鰓組織GST 活性升高。有研究表明，短時間低劑量污染物暴露可導致機體GST 活性的誘導表達，但長時間或者高劑量的脅迫則能夠抑制GST 的活性或表達（任加云等，2006）。

聯(lián)合暴露組消化腺組織CAT 和SOD 活性低于單一暴露組。Skdokur 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，在微塑料和汞聯(lián)合暴露條件下，菲律賓蛤仔（R.philippinarum）消化腺組織CAT 活性被抑制，而鰓組織CAT 活性受到誘導升高，這與我們的研究結果類似。CAT 和SOD 活性被抑制可能是因為聯(lián)合脅迫產生了更多的自由基蓄積，導致抗氧化系統(tǒng)損傷和補償機制的喪失。微塑料和芘暴露激活了菲律賓蛤仔消化腺組織的GST 活性。Gehringer 等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，有毒物質進入動物體內，主要通過肝臟的谷胱甘肽還原機制解毒，這可能是GST在本研究中活性較高的原因之一。然而，GST 活性的增加可能并不足以防止氧化損傷，因為本研究發(fā)現(xiàn)消化腺脂質過氧化增加。此外，在單一微塑料暴露下，消化腺GST 活性與對照組相比沒有顯著性差 異。 前 期 研 究 發(fā) 現(xiàn)， 紫 貽 貝 （M.galloprovincialis）在1.5 g/L 微塑料（<100 滋m）暴露7 d 后，其消化腺組織GST 活性并未發(fā)生變化（Avio et al，2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于L-pyrene暴露組，H-pyrene 暴露組中，脂質過氧化水平增加且消化腺CAT 和SOD 活性以及鰓組織CAT 和GST 活性均下降?？梢姡w和消化腺組織抗氧化酶活性和脂質過氧化水平的反應并不一致，可能是由于污染物的生物利用度差異導致。

3.4 綜合生物標志物分析

綜合生物標志物分析已被廣泛應用于污染物對水生動物的綜合毒性效應評價（Damiens et al，2007；Raftopoulou et al，2010），高IBR 值表明被測生物體遭受了較高的脅迫壓力（Turja et al，2014）。在本研究中，消化腺的IBR 值高于鰓，表明污染物對消化腺的毒性作用更大。Teng 等（2021）運用IBR 定量評價了聚乙烯（PE）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）脅迫后，牡蠣（C.gi原gas）鰓和消化腺組織中生物標志物的變化情況，發(fā)現(xiàn)消化腺組織對微塑料脅迫響應值大于鰓組織。本研究中，H-pyrene 暴露組IBR 響應值高于Lpyrene 暴露組。Kim 等（2016）發(fā)現(xiàn)鯉魚（Cypri原nus carpio）暴露于PAHs 時，IBR 值隨PAHs 濃度的增加而增加。同樣，李磊等（2018） 通過IBR評價了BaP 暴露后脊尾白蝦（Exopalaemon carini原cauda） 的生物標志物響應，結果發(fā)現(xiàn)IBR 值與BaP 暴露濃度存在劑量依賴效應，且肌肉和肝胰臟組織對BaP 脅迫響應存在差異性，表明IBR 可作為評價多個生物標志物對PAHs 暴露響應的定量工具。BMPs 和芘聯(lián)合暴露組的IBR 值高于單一暴露組，這表明BMPs 和芘對菲律賓蛤仔復合毒性效應表現(xiàn)為協(xié)同效應。

4 結論

本文以菲律賓蛤仔為研究對象，探討了微塑料和芘對其生理活動、免疫防御和氧化應激的影響。結果發(fā)現(xiàn)，微塑料的存在顯著抑制了菲律賓蛤仔的攝食率。微塑料和芘暴露均能導致菲律賓蛤仔出現(xiàn)不同程度的氧化應激現(xiàn)象，聯(lián)合暴露對菲律賓蛤仔的氧化損傷程度高于單獨暴露且能夠顯著抑制血細胞的吞噬活性。相較于較大粒徑微塑料（6 滋m），小粒徑微塑料（0.3 滋m）加劇了鰓組織的脂質過氧化程度和芘對血細胞的免疫毒性。由此可見，微塑料和有機污染物聯(lián)合作用可能會對海洋生物產生更大的毒性效應。因此，開展微塑料與有機污染物的聯(lián)合毒性效應研究，將是今后微塑料毒性評價的重要方向之一。