不同藥劑誘導(dǎo)玉米無融合生殖快速獲得二倍體技術(shù)研究

姚威港， 王曉東， 李志剛， 史 鐸， 劉 鵬

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028000)

玉米是我國(guó)重要的糧食作物，玉米生產(chǎn)直接關(guān)系到我國(guó)的糧食安全問題。2017—2019年全國(guó)平均玉米種植面積達(dá)4 173萬hm2，占糧食總面積的43.6%[1]，居世界首位。據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)部門統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)良種增產(chǎn)貢獻(xiàn)率為43%，美歐發(fā)達(dá)國(guó)家達(dá)到60%以上。業(yè)內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)玉米新品種在糧食增產(chǎn)中的貢獻(xiàn)率在35%以上[2]。因此，加強(qiáng)玉米育種新技術(shù)研究對(duì)加快種質(zhì)創(chuàng)新速度、提升新品種水平、加大遺傳增益，促進(jìn)新品種更新?lián)Q代意義重大。因此，加快品種更新迫在眉睫，而新品種的選育首先是自交系的創(chuàng)新和快速更新。

本研究以除草劑誘導(dǎo)玉米無融合生殖的方法進(jìn)行快速選育玉米自交系，可在誘導(dǎo)當(dāng)代直接獲得二倍體種子，大大縮短了育種周期；但在該技術(shù)使用過程中誘導(dǎo)劑篩選、誘導(dǎo)劑濃度、處理時(shí)期等方面還不夠完善。因此，本研究對(duì)該技術(shù)進(jìn)行研究，旨在優(yōu)化除草劑誘導(dǎo)玉米無融合生殖技術(shù)，為其大規(guī)模推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年供試材料為萬糯2000和TK 601；2020年供試材料為萬糯2000。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019年試驗(yàn)在內(nèi)蒙古民族大學(xué)科技園區(qū)進(jìn)行，采用裂-裂區(qū)設(shè)計(jì)，品種為主區(qū)，試劑種類為副處理，試劑濃度為亞副處理，3次重復(fù)。小區(qū)行長(zhǎng)5 m，行距0.6 m，密度4 500株·(667 m2)-1。

2020年在2019年的基礎(chǔ)上利用上一季篩選出的最佳試劑濃度進(jìn)行處理時(shí)期誘導(dǎo)試驗(yàn)。小區(qū)行長(zhǎng)5 m，行距0.6 m，密度4 500株·(667 m2)-1。

1.3 試驗(yàn)試劑、試劑濃度及處理時(shí)期

本試驗(yàn)采用5種不同誘導(dǎo)藥劑，每種試劑分為5個(gè)不同濃度，分別為20、40、80、160、320 μmol·L-1。具體名稱及濃度見表1。處理時(shí)期設(shè)吐絲后第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天。

表1 不同誘導(dǎo)劑及其濃度

1.4 誘導(dǎo)方法

雌穗抽絲前全部套袋，并去掉雄穗以防止污染。當(dāng)花絲長(zhǎng)至 3～4 cm時(shí)，用消毒后的尖嘴鉗割平花絲，在雌蕊頂端凹槽注射不同濃度的誘導(dǎo)液，再將紙袋套好，每個(gè)處理誘導(dǎo)2行，3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

成熟后逐穗檢查結(jié)實(shí)情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)株率，即結(jié)實(shí)株數(shù)所占處理株數(shù)的百分比。結(jié)實(shí)株率使用Excel軟件分析。

采用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同試劑對(duì)玉米誘導(dǎo)效果的影響

表2顯示，不同類型玉米間差異顯著，試劑、試劑濃度差異極顯著；品種×試劑濃度、試劑×試劑濃度、品種×試劑×試劑濃度互作效應(yīng)顯著，其余互作效應(yīng)不顯著。

表2 不同試劑對(duì)不同類型玉米誘導(dǎo)效果的方差分析

由表3可知，兩品種間誘導(dǎo)效果存在一定差異，萬糯2000的結(jié)實(shí)株率較TK 601高3.91%，且差異達(dá)顯著水平。說明不同類型玉米對(duì)誘導(dǎo)效果有較大影響。

表3 不同類型玉米品種間誘導(dǎo)效果差異分析

由表4可知，不同試劑對(duì)玉米的誘導(dǎo)效果存在差異，聚乙烯亞胺的結(jié)實(shí)株率高于其他試劑，分別較氟樂靈、秋水仙素、戊炔草胺、青鮮素高8.66%、56.90%、25.52%、6.12%，且與秋水仙素、戊炔草胺間差異達(dá)極顯著水平，與氟樂靈、青鮮素間差異不顯著。氟樂靈與青鮮素的結(jié)實(shí)株率較為接近，差異不顯著；二者與秋水仙素、戊炔草胺間差異達(dá)極顯著水平。說明不同試劑對(duì)玉米的誘導(dǎo)效果影響較大。

表4 不同試劑對(duì)玉米誘導(dǎo)株率比較

2.2 不同試劑濃度對(duì)玉米誘導(dǎo)效果的影響

由表5可以看出，5種試劑對(duì)兩品種的誘導(dǎo)效果均表現(xiàn)出隨濃度的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)。氟樂靈以80 μmol·L-1時(shí)的誘導(dǎo)效果最佳，兩品種的結(jié)實(shí)株率分別為42.5%和47.6%，與20 μmol·L-1和320 μmol·L-1濃度下的結(jié)實(shí)株率間差異達(dá)極顯著水平。

表5 不同處理濃度對(duì)玉米誘導(dǎo)株率的差異分析

聚乙烯亞胺對(duì)TK 601以濃度為80 μmol·L-1時(shí)的誘導(dǎo)效果最佳，而對(duì)萬糯2000則以40 μmol·L-1時(shí)的誘導(dǎo)效果最佳，且與其他濃度間差異達(dá)顯著或極顯著水平。秋水仙素對(duì)兩品種的誘導(dǎo)均以80 μmol·L-1時(shí)誘導(dǎo)效果較好，且對(duì)TK 601的誘導(dǎo)結(jié)實(shí)株率極顯著高于其他濃度。戊炔草胺的誘導(dǎo)以40 μmol·L-1和80 μmol·L-1時(shí)的誘導(dǎo)效果較好，對(duì)TK 601的誘導(dǎo)結(jié)實(shí)株率明顯高于其他濃度，差異達(dá)極顯著水平。秋水仙素和戊炔草胺對(duì)萬糯2000的誘導(dǎo)效果整體不理想，這與試劑及品種有關(guān)。青鮮素對(duì)兩品種的誘導(dǎo)效果均以80 μmol·L-1時(shí)最佳，且對(duì)萬糯2000的誘導(dǎo)結(jié)實(shí)株率與其他濃度間差異達(dá)極顯著水平。

可見，用化學(xué)試劑誘導(dǎo)玉米無融合生殖時(shí)，試劑濃度過低或過高都會(huì)嚴(yán)重降低結(jié)實(shí)株率，影響誘導(dǎo)效果。

2.3 處理時(shí)期對(duì)玉米誘導(dǎo)效果的影響

如表6所示，不同的處理時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)效果具有較大影響。不同處理時(shí)期間的誘導(dǎo)效果差異達(dá)極顯著水平。試劑種類與處理時(shí)期的互作效應(yīng)中，誘導(dǎo)效果無顯著性差異。

表6 不同處理時(shí)期誘導(dǎo)效果方差分析

由表7可知，使用5種試劑對(duì)玉米不同吐絲時(shí)期進(jìn)行誘導(dǎo)，從不同吐絲天數(shù)的結(jié)實(shí)株率來看，5種試劑的誘導(dǎo)效果均隨吐絲天數(shù)的增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，氟樂靈、聚乙烯亞胺、秋水仙素、戊炔草胺和青鮮素的誘導(dǎo)結(jié)實(shí)株率的變異幅度分別為12.2%～37.5%、11.2%～40.4%、9.6%～33.9%、10.0%～33.8%和11.0%～35.9%，5種試劑均以吐絲第5天效果最佳，結(jié)實(shí)株率分別為37.5%、40.4%、33.9%、33.8%和35.9%，且顯著高于其他處理。

表7 不同處理時(shí)期誘導(dǎo)效果比較

可見，不同處理時(shí)期對(duì)玉米無融合生殖的影響較大，這也是利用化學(xué)試劑誘導(dǎo)玉米無融合生殖需要考慮的重要因素。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同試劑對(duì)誘導(dǎo)效果的影響

目前，國(guó)內(nèi)外研究者通過不同誘導(dǎo)劑對(duì)玉米誘導(dǎo)效果的研究，篩選出秋水仙素(Col)、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)等不同誘導(dǎo)劑[3-5]。Wan等[6]和Stadler等[7]的試驗(yàn)表明，低毒性的除草劑可以代替秋水仙素使植物細(xì)胞加倍，且傷害程度和誘導(dǎo)效果優(yōu)于秋水仙素。本研究除了使用秋水仙素這一高毒性的誘導(dǎo)劑外，還使用了戊炔草胺、氟樂靈，聚乙烯亞胺、青鮮素等一系列低毒性的誘導(dǎo)劑，發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺的平均誘導(dǎo)株率為36.4%；氟樂靈的平均誘導(dǎo)株率為33.5%；戊炔草胺的平均誘導(dǎo)株率為29.0%；青鮮素的平均誘導(dǎo)株率為35.1%，而秋水仙素的平均誘導(dǎo)株率為23.2%。因此，聚乙烯亞胺、氟樂靈、青鮮素及戊炔草胺均可替代秋水仙素，聚乙烯亞胺、氟樂靈、青鮮素較為理想，且聚乙烯亞胺為本試驗(yàn)篩選出最新誘導(dǎo)劑。由此可見，采用毒性較低的新型誘導(dǎo)劑代替秋水仙素不僅可以提高誘導(dǎo)率，同時(shí)更加安全環(huán)保。

3.2 不同試劑濃度對(duì)誘導(dǎo)效果的影響

本試驗(yàn)使用20、40、80、160、320 μmol·L-1等5種濃度的除草劑對(duì)玉米進(jìn)行誘導(dǎo)處理，結(jié)果表明，隨著試劑濃度的升高，對(duì)玉米誘導(dǎo)株率的影響呈先增高再降低的趨勢(shì)，且試劑濃度在80 μmol·L-1時(shí)誘導(dǎo)效果最佳。這也驗(yàn)證了惠國(guó)強(qiáng)等[14]的研究結(jié)果，隨著除草劑濃度的加大，對(duì)玉米幼苗的抑制加大,總的加倍率先升后降。

各個(gè)濃度試劑對(duì)玉米誘導(dǎo)株率均有明顯差異，除戊炔草胺和聚乙烯亞胺在40 μmol·L-1和80 μmol·L-1誘導(dǎo)效果均較好以外，其他試劑濃度均在80 μmol·L-1時(shí)對(duì)玉米的誘導(dǎo)株率顯著高于其他4個(gè)濃度，這也與任燕靜[8]的研究結(jié)果一致。

因此，所用試劑作為一種新型藥物誘導(dǎo)玉米無融合快速獲得二倍體是可行的，但是不同濃度試劑對(duì)玉米誘導(dǎo)株率的影響程度不同。因此，在今后研究中要著重探究濃度對(duì)加倍率的影響，針對(duì)不同試劑的濃度進(jìn)一步提高玉米的誘導(dǎo)株率。

3.3 不同處理時(shí)期對(duì)玉米誘導(dǎo)效果的影響

通過對(duì)7個(gè)不同吐絲期的玉米進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)不同處理時(shí)期的無融合生殖誘導(dǎo)效果有較大差異。其中，最佳誘導(dǎo)期為吐絲后第5天，結(jié)實(shí)株率明顯高于其他時(shí)期，平均高出6%～10%。這說明花絲新老對(duì)藥劑相對(duì)敏感度高低有關(guān)。這也與余建華等[9]、任燕靜等[10]、張?zhí)降萚13]的研究結(jié)果基本一致。而趙念力等[11]和于運(yùn)凱等[12]認(rèn)為，同一化學(xué)藥劑不同的誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)玉米孤雌生殖的誘導(dǎo)率有明顯的差異，誘導(dǎo)最佳時(shí)間為雌穗吐絲后3天。本研究結(jié)果與之有差異，這可能是因?yàn)樘幚聿牧?，環(huán)境等因素的不同而造成的。

3.4 不同類型玉米品種間對(duì)誘導(dǎo)效果的影響

本試驗(yàn)采用2個(gè)不同遺傳背景玉米品種誘導(dǎo)玉米無融合生殖，兩品種的誘導(dǎo)株率呈顯著性差異，其中糯玉米萬糯2000的誘導(dǎo)效果優(yōu)于普通玉米TK 601[11-12]，說明不同基因型玉米對(duì)誘導(dǎo)株率有較大影響。相關(guān)研究表明，不同遺傳背景的玉米品種對(duì)于玉米無融合生殖的影響較大，不同遺傳背景間玉米差異甚至達(dá)到顯著或極顯著水平[9-15]。本研究結(jié)果與上述研究一致，由此可見，在化學(xué)試劑誘導(dǎo)玉米無融合生殖的過程中，要著重考慮不同基因型玉米所帶來的影響。