Survivin、Ki67及HPV16-E6的聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制

陳麗珍 沈菲 李菁

[摘要] 目的 探討存活素（Survivin）、Ki67及人乳頭狀瘤病毒（HPV）16-E6聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。 方法 選擇2018年1月至2020年12月我院收治的130例女性患者，其中正常對(duì)照組32例，低級(jí)別CIN組36例，高級(jí)別CIN組34例，宮頸癌組28例。所有患者均行免疫組化及流式細(xì)胞學(xué)檢查。分析各組免疫組化檢測(cè)結(jié)果、各組流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，另分析各蛋白在宮頸癌表達(dá)中的相關(guān)性。 結(jié)果 宮頸癌組Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白陽(yáng)性率均高于高級(jí)別CIN組及低級(jí)別CIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低級(jí)別CIN組、高級(jí)別CIN組與宮頸癌組Survivin、Ki67、HPV16-E6蛋白FI值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Survivin、Ki67相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，r=0.534，一致性檢驗(yàn)Kappa=0.512，P=0.006;Ki67及HPV16-E6蛋白相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，r=0.714，Kappa=0.708，P=0.000;Survivin及HPV16-E6蛋白相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，r=0.523，Kappa=0.627，P=0.001。 結(jié)論 Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展間存在密切聯(lián)系，檢測(cè)各指標(biāo)進(jìn)行宮頸癌早期篩查，利于盡早發(fā)現(xiàn)病變。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌;宮頸上皮內(nèi)瘤變;宮頸癌前病變;人乳頭狀瘤病毒;存活素;Ki67

[中圖分類號(hào)] R737.33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）36-0009-04

Mechanism of action of Survivin， Ki67 and HPV16-E6 combined detection in occurrence and development of cervical cancer

CHEN Lizhen? ?SHEN Fei? ?LI Jing

Department of Obstetrics and Gynecology， the First People's Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen? ?333000，China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of action of combined detection of Survivin， Ki67 and human papillomavirus（HPV） 16-E6 in the occurrence and development of cervical cancer. Methods A total of 130 female patients who were admitted to our hospital from January 2018 to December 2020 were selected， including 32 patients in the normal control group， 36 patients in the low grade CIN group， 34 patients in the high grade CIN group and 28 patients in the cervical cancer group. All patients were examined by the immunohistochemistry and flow cytometry. Immunohistochemical results and flow cytometry results of each group were analyzed， and the correlation of each protein in the cervical cancer expression was analyzed. Results? The positive rates of Survivin， Ki67 and HPV16-E6 protein in cervical cancer group were higher than those in the high grade CIN group and the low grade CIN group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Survivin， Ki67 and HPV16-E6 protein FI values of the low grade CIN group， the high grade CIN group and the cervical cancer group were significantly different （P<0.05）. The Survivin and Ki67 correlation test showed r=0.534， the consistency test Kappa=0.512， P=0.006. The Ki67 and HPV16-E6 protein correlation test showed r=0.714， Kappa=0.708， P=0.000. The Survivin and HPV16-E6 protein correlation test showed r=0.523， Kappa=0.627， P=0.001. Conclusion Survivin， Ki67 and HPV16-E6 proteins are closely related to the occurrence and development of cervical cancer， and detection of these indicators is conducive to early detection of cervical cancer.

[Key words] Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; Cervical precancerous change; Human papillomavirus; Survivin; Ki67

宮頸癌屬婦科惡性腫瘤，其中人乳頭狀瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變（Cervical intraepithelial neoplasias，CIN）屬于宮頸癌前病變，若可盡早發(fā)現(xiàn)CIN，對(duì)宮頸癌預(yù)防具有重要作用[2-3]。存活素（Survivin）參與了多種血管因子的相互作用，可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及毛細(xì)血管的退化，在宮頸癌發(fā)生及發(fā)展中意義重大[4-5];Ki67抗原為非組蛋白，水平越高，腫瘤惡性程度越高，預(yù)后較差，反之，預(yù)后越好[6-7];臨床依據(jù)HPV病毒基因區(qū)可分為多個(gè)區(qū)，E6作為多功能蛋白還可通過(guò)激活端粒酶使得正常細(xì)胞永生化，與其他蛋白存在相互作用[8-9]。鑒于此，本研究采用Survivin、Ki67及HPV16-E6的聯(lián)合檢測(cè)，旨在探討在宮頸癌中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2020年12月于我院就診的女性患者130例，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采集所有患者的宮頸組織，其中正常對(duì)照組32例，低級(jí)別CIN組36例，高級(jí)別CIN組34例，宮頸癌組28例。其中正常對(duì)照組年齡38～52歲，平均（45.57±3.61）歲;孕次1～4次，平均（2.05±0.63）次;產(chǎn)次1～3次，平均（1.84±0.43）次。低級(jí)別CIN組年齡37～52歲，平均（45.60±3.59）歲;孕次1～4次，平均（2.13±0.60）次;產(chǎn)次1～3次，平均（1.78±0.40）次。高級(jí)別CIN組年齡37～53歲，平均（45.81±3.71）歲;孕次1～5次，平均（2.20±0.59）次;產(chǎn)次1～4次，平均（1.80±0.42）次。宮頸癌組年齡36～53歲，平均（45.79±3.68）歲;孕次1～5次，平均（2.19±0.67）次;產(chǎn)次1～4次，平均（2.18±0.60）次。四組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者術(shù)前均未接受放、化療治療，且均經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷[10];②簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①癌細(xì)胞已發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移者;②其他重要臟器功能障礙者;③病歷資料不全者;④精神疾病，無(wú)法配合完成本研究者。

1.3 方法

（1）免疫組化S-P法：①對(duì)石蠟標(biāo)本行連續(xù)切片，大小為4 cm，將其平鋪于APES的載玻片上，并置于恒溫67℃烤箱中過(guò)夜。②過(guò)夜切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脫蠟10 min;③將標(biāo)本置于100%酒精內(nèi)5 min，再置于90%酒精內(nèi)5 min，隨后再置入70%酒精內(nèi)5 min，最終使用自來(lái)水大量沖洗標(biāo)本后用蒸餾水沖洗3 min。④將標(biāo)本孵育20～25 min，并將其置入含有3%甲醇過(guò)氧化氫溶液中，隨后用蒸餾水沖洗切片，每次3 min，沖洗3次，隨后置于0.01 M PBS內(nèi)5 min。⑤將Survivin及HPV16-E6置于PBS液壓高壓鍋內(nèi)噴氣150 s，Ki67置于含有枸櫞酸鈉溶液高壓鍋內(nèi)噴氣4 min，隨后將三種置于溫室內(nèi)冷卻，隨后2次放入PBS溶液內(nèi)，5 min/次。⑥吸出多余液體，用血清封閉，置于濕盒中孵育45 min，保證濕盒溫度為37℃;⑦倒去血清，滴加50 μL抗工作液，將其置于4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜，PBS沖洗3次，5 min/次。⑧將二抗工作液滴入標(biāo)本中，置于濕盒內(nèi)孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次;⑨于樣本中滴加鏈酶卵白素工作液，并在37℃環(huán)境中孵育30 min，PBS沖洗5 min，共沖洗3次。⑩DAB染色。使用中性樹(shù)膠等物質(zhì)封片，于顯微鏡下進(jìn)行觀察，將PBS代替一抗作為空白對(duì)照，另之前標(biāo)本使用70%乙醇固定，用于流式細(xì)胞檢測(cè)。（2）流式細(xì)胞檢查方法：①將標(biāo)本置于120目不銹鋼網(wǎng)上，隨后使用眼科常用的組織剪剪碎試驗(yàn)標(biāo)本組織，使用眼科鑷子進(jìn)行揉搓塊，在此過(guò)程中，大量沖洗標(biāo)本，直至標(biāo)本揉搓完畢，使用300目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾掉懸浮液中的團(tuán)塊，離心處理后獲得細(xì)胞懸液，將其置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)錂z，制備106/mL合格單細(xì)胞懸液。②于單細(xì)胞懸液中加入各蛋白工作液100 μL，在室溫條件下孵育30 min，使用10 mL PBS溶液進(jìn)行稀釋，再次行離心操作撇去上層清液，加入各蛋白抗體，用500目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，隨后加入500 μLPBS液懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至106/mL，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。③應(yīng)用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司，EPICS XL Ⅱ型），10 000個(gè)細(xì)胞/次，另應(yīng)用Expo 32 ADC軟件行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，測(cè)定相關(guān)結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo)

①分析各組免疫組化檢測(cè)結(jié)果。②分析各組流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。③分析各蛋白在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)性分析及Kappa一致性檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白于各組中的免疫組化檢測(cè)結(jié)果

宮頸癌組Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白陽(yáng)性率均高于高級(jí)別CIN組及低級(jí)別CIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1、封三圖3～14。

2.2 Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白FI值比較

正常對(duì)照組及低級(jí)別CIN組各蛋白FI值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;低級(jí)別CIN組、高級(jí)別CIN組與宮頸癌組Survivin、Ki67、HPV16-E6蛋白FI值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 相關(guān)性分析

Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白在宮頸癌組織中均呈正相關(guān)，Survivin、Ki67相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，r=0.534，一致性檢驗(yàn)Kappa=0.512，P=0.006;另Ki67及HPV16-E6蛋白相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，r=0.714，Kappa=0.708，P=0.000;Survivin及HPV16-E6蛋白相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，r=0.523，Kappa=0.627，P=0.001。

3 討論

宮頸癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。研究顯示[11-12]，Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白的表達(dá)高低與宮頸癌形成間存在密切聯(lián)系，依據(jù)其表達(dá)能力的強(qiáng)弱，有助于判斷患者病情嚴(yán)重程度，對(duì)評(píng)估患者預(yù)后意義重大。

細(xì)胞有絲分裂初期，Survivin在微管動(dòng)力作用下能夠維持正常的有絲分裂秩序，發(fā)揮Survivin抑制細(xì)胞凋亡的作用[13-14]。另Survivin在血管中具有重要作用，血管形成時(shí)，受到生長(zhǎng)因子等因素刺激，各細(xì)胞不斷分裂及重塑，形成原始血管及開(kāi)放血管，在此過(guò)程中若破壞基質(zhì)與內(nèi)皮細(xì)胞的連接，將對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)造成影響，進(jìn)而引發(fā)血管結(jié)構(gòu)退化[15-16]。Ki67為非組蛋白，具有預(yù)測(cè)化療不良反應(yīng)的作用。由于宮頸癌術(shù)前需進(jìn)行輔助化療，以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)或縮小腫瘤體積的目的[17-18]。但在臨床應(yīng)用中并非所有患者均對(duì)化療敏感，若患者對(duì)化療不敏感，于化療前行Ki67測(cè)定，觀察其水平是否為高表達(dá)，以預(yù)測(cè)患者對(duì)輔助化療的反應(yīng)及預(yù)后[19-20]。HPV16為HPV中的高危型，Ki67被認(rèn)為與高危型HPV間聯(lián)系密切，上述兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)用有助于篩查宮頸癌高危人群[21-22]。HPV16-E6蛋白與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白間具有相互作用，能夠周期調(diào)控及干擾正常細(xì)胞運(yùn)行，促使細(xì)胞無(wú)限量增殖[23]。相關(guān)研究結(jié)果顯示[24-25]，HPV16-E6陽(yáng)性組中患者Ki67的免疫細(xì)胞數(shù)高于其他類型的HPV。故可將Ki67作為診斷CIN不同時(shí)期及早期宮頸癌篩查的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組各蛋白陽(yáng)性率均高于高級(jí)別CIN組及低級(jí)別CIN組，低級(jí)別CIN組、高級(jí)別CIN組與宮頸癌組Survivin、Ki67、HPV16-E6蛋白FI值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各蛋白在宮頸癌組織中均呈正相關(guān)，Ki67及HPV 16-E6蛋白檢驗(yàn)相關(guān)性及一致性最強(qiáng)，r=0.714，Kappa=0.708。表明Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展，其中Ki67及HPV16-E6蛋白與宮頸癌發(fā)生的聯(lián)系更加密切，依據(jù)其水平變化、相關(guān)性、一致性等可有效篩查宮頸癌高危人群，為臨床診療提供可靠依據(jù)。

綜上所述，Survivin、Ki67及HPV16-E6聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌病變發(fā)展過(guò)程中相互作用，可將其作為診斷早期宮頸癌的重要指標(biāo)，為腫瘤預(yù)防及預(yù)后評(píng)估提供重要信息。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 閻冰冰，金芬，王忠民，等.人乳頭瘤病毒在宮頸癌、宮頸癌前病變和宮頸炎癥中的水平及其臨床意義[J].實(shí)用癌癥雜志，2018，33（10）：1724-1726.

[2] 劉霞，張喬，張慧杰.人乳頭瘤病毒16型DNA整合對(duì)宮頸癌變的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2020，30（9）：28-33.

[3] 孫靜，王曉燕.人乳頭瘤病毒在宮頸癌篩查中的價(jià)值[J].中國(guó)藥物與臨床，2019，19（15）：2625-2626.

[4] 王曉丹，湯麗榮.高危型人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌前病變的相關(guān)性研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2020，49（9）：137-140.

[5] 李桂湖.Survivin、p53在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)生育健康雜志，2017，28（3）：280-281，285.

[6] 蔭偉.小分子Survivin抑制劑YM155對(duì)人子宮頸癌SiHa和ME-180細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制研究[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2018，15（5）：320-326.

[7] 唐梅，尤共平，林麗慧，等.EZH2和Ki-67在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志，2018，19（1）：12-15.

[8] 馬淑云，雷潔，張欣，等.Ki-67、p16及EGFR表達(dá)與老年宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后的相關(guān)性[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2019，39（11）：2635-2639.

[9] 陶志梅，潘敏，俞美娟，等.高危型人乳頭瘤病毒感染聯(lián)合液基薄層細(xì)胞檢測(cè)對(duì)宮頸癌及宮頸癌前病變篩查與隨訪的臨床意義[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017，27（10）：2340-2343.

[10] 柯然利，孫慧兒，喻燕雯.人乳頭狀瘤病毒分型及腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌前病變及宮頸癌中的診斷應(yīng)用分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2018，28（12）：1476-1478.

[11] 馬天有，歸巧娣，施瑞潔，等.RNA干擾抑制HPV16E6基因的表達(dá)對(duì)HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞中基因表達(dá)譜的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25（19）：3058-3063.

[12] 遲龍青，楊薇薇，劉宇，等.宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16-E6基因整合/整合率與臨床病理資料相關(guān)性分析[J].國(guó)際免疫學(xué)雜志，2018，41（1）：19-22.

[13] 崔紅香.β-catenin，survivin在Ⅰa1～Ⅱa2期宮頸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2019，26（11）：1879-1883.

[14] 周成友，杜陽(yáng)，趙靜，等.子宮頸癌中miR-153和Survivin的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2020，36（3）：311-315.

[15] 賈利剛，褚兆蘋(píng)，田菲，等. XIAP、cyclin D1及survivin在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義[J].癌癥進(jìn)展，2018，16（10）：1281-1283，1302.

[16] 施璠，汪濤，王娟，等.宮頸癌組織中Survivin、UHRF1 mRNA表達(dá)及其與宮頸癌放療敏感性的相關(guān)性[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，41（1）：23-26.

[17] 周靜，李智，周玉，等.宮頸癌組織中Ep-CAM和Ki67的表達(dá)及臨床意義[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2019，34（6）：24-27.

[18] 張佳佳，王萍.Scc、CA125和Ki67在宮頸癌和癌前病變?cè)\斷中的價(jià)值[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2017，30（7）：739-741.

[19] 姚珊瑚，陳寧，劉維娜，等.宮頸脫落細(xì)胞Ki67和exportin-5表達(dá)用于宮頸癌篩查的初步研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2019，29（12）：1427-1430.

[20] 張睿怡，郭紅燕，游珂，等.p16INK4a/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染在檢出宮頸癌及癌前病變中的作用[J].腫瘤預(yù)防與治療，2017，30（6）：427-432.

[21] 史春，葛菲，溫云花.HPV16E6及HPV16E7蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2018， 30（8）：29-32.

[22] 孫麗艷，陶萍萍，楊賓烈，等.宮頸HPV16持續(xù)感染階段宮頸P16和Ki67的表達(dá)及其與宮頸癌變的關(guān)系[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，18（21）：4103-4106.

[23] 程瑩星，黃勇.HPV16-E6-DNA對(duì)宮頸癌預(yù)后價(jià)值分析[J].河北醫(yī)學(xué)，2017，23（12）：1944-1948.

[24] 詹曉芬，王少洪，吳璇，等.HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合P16/ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染色檢測(cè)在不典型鱗狀細(xì)胞（ASCUS）分流診斷中的作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2018，34（10）：937-941.

[25] 陳飛，任琛琛，楊立，等.HPV E6/E7 mRNA，p16/Ki67檢測(cè)在ASCUS中的診斷價(jià)值[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2019， 28（1）：54-57.

（收稿日期：2021-09-01）