兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片的體外構(gòu)建

徐燕梅， 卓 瑾， 許雄程， 何夢嬌， 林敏魁， 駱 凱， 朱麗芳

目前頜面部骨缺損常采用骨移植進(jìn)行修復(fù)，但存在成骨效率低及免疫反應(yīng)等不足。組織工程技術(shù)為頜面部骨組織缺損修復(fù)提供了一個新的治療方式。其中，細(xì)胞膜片技術(shù)無需酶消化，可保留完整的細(xì)胞間連接及胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)組織工程技術(shù)的缺點[1]。近年來，細(xì)胞膜片技術(shù)已被應(yīng)用于各種組織再生研究中。Ohki等[2]于2009年首次將體外構(gòu)建的人口腔黏膜上皮細(xì)胞膜片移植于食道癌患者體內(nèi)，成功修補(bǔ)了缺損組織，這一開創(chuàng)性臨床試驗表明細(xì)胞膜片技術(shù)在臨床診療中擁有巨大的潛能。Chen等[3]在將人牙周韌帶干細(xì)胞膜片移植于牙周缺損中，證實該牙周韌帶干細(xì)胞膜片在體內(nèi)具有良好的生物安全性。骨膜細(xì)胞位于骨組織表面的纖維組織內(nèi)其來源豐富，能夠自我更新，并能夠多向分化，在骨組織再生修復(fù)中發(fā)揮重要的作用[4]。已有研究將骨膜移植于人上頜骨，成功實現(xiàn)了骨組織再生，提示骨膜細(xì)胞可成為骨缺損修復(fù)的種子細(xì)胞[5]。本研究擬采用維生素C連續(xù)誘導(dǎo)法構(gòu)建兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片，并對其基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為利用骨膜細(xì)胞膜片修復(fù)頜面部骨缺損提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 4月齡雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量2.2～2.4 kg[上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場(許可證號：SCXK(滬)2017-0008)]。

1.1.2 材料 改良Eagle培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(澳大利亞Wisent公司)；Ⅱ型膠原酶、維生素 C、茜素紅(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；磷酸鹽緩沖液(以色列BI公司)；兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(中國賽業(yè)生物科技有限公司)；Masson 染液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；結(jié)晶紫(中國西隴化工股份有限公司)；蘇木精、伊紅(中國賽維爾生物科技有限公司)；細(xì)胞活死熒光染色試劑(美國Abcam公司)；堿性磷酸酶試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.3 儀器 石蠟組織切片機(jī)(德國Leica公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(中國力新儀器有限公司)；超凈工作臺(中國蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生物組織包埋機(jī)(中國金華科迪儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔脛骨骨膜細(xì)胞體外培養(yǎng) 無菌狀態(tài)下剝離兔脛骨骨膜，沖洗，組織剪碎成1 mm×1 mm大小，Ⅱ型膠原酶消化后，置入含10%胎牛血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待骨膜組織塊之間細(xì)胞達(dá)70%～80%融合后，對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 兔脛骨骨膜細(xì)胞增殖能力檢測 將兔脛骨骨膜細(xì)胞以每孔2×103個接種于96孔板內(nèi)，按照CCK-8試劑盒操作說明，檢測培養(yǎng)1、3、5和7 d細(xì)胞的增殖能力。

1.2.3 兔脛骨骨膜細(xì)胞克隆形成能力檢測 將兔脛骨骨膜細(xì)胞以每孔1×103個接種于6孔板內(nèi)，每3 d 換液，克隆集落形成后行結(jié)晶紫染色，拍照。

1.2.4 兔脛骨骨膜細(xì)胞多向分化能力檢測 將兔脛骨骨膜細(xì)胞以每孔5×104個接種于12孔板，分別進(jìn)行多向誘導(dǎo)，采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、茜素紅、油紅O及阿爾辛藍(lán)染色檢測兔脛骨骨膜細(xì)胞的成骨、成脂及成軟骨分化的能力。

1.2.5 兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片構(gòu)建及組織形態(tài)學(xué)觀察 將兔脛骨骨膜細(xì)胞以每孔5×104個的密度接種于12孔板，加入維生素C膜片誘導(dǎo)液，每3 d換液。連續(xù)誘導(dǎo)14 d，待孔底部出現(xiàn)透明白色膜狀物，采用細(xì)胞活死熒光染色檢測膜片活力。分離細(xì)胞膜片，石蠟包埋切片后Masson及蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, H-E染色)。

2 結(jié) 果

2.1 兔脛骨骨膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及增殖能力、克隆形成能力檢測 兔脛骨骨膜經(jīng)Ⅱ型膠原酶酶消化后置于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3 d，可見骨膜組織塊邊緣有細(xì)胞爬出，細(xì)胞形態(tài)主要呈短梭形或三角形(圖1A)，傳代后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)無變化(圖1B)。選擇3代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行實驗。CCK-8檢測結(jié)果顯示，兔脛骨骨膜細(xì)胞生長曲線呈S型增長(圖1C)。體外培養(yǎng)10 d，可見細(xì)胞克隆集落形成，結(jié)晶紫染色呈藍(lán)色(圖1D)。

A：原代細(xì)胞培養(yǎng)3 d( ×100)；B：第3代骨膜細(xì)胞( ×100)；C：脛骨骨膜細(xì)胞生長曲線；D：脛骨骨膜細(xì)胞結(jié)晶紫染色( ×100)。圖1 兔脛骨骨膜細(xì)胞體外培養(yǎng)Fig.1 Culture of rabbit tibial periosteal cells in vitro

2.2 兔脛骨骨膜細(xì)胞多向分化能力鑒定 兔脛骨骨膜細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，ALP染色呈深藍(lán)色(圖2A)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，茜素紅染色可見大小不一、紅染的礦化結(jié)節(jié)(圖2B)；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，可見脂滴形成，經(jīng)油紅O染色脂滴呈紅色(圖2C)；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，經(jīng)阿爾辛藍(lán)染色細(xì)胞呈藍(lán)色(圖2D)。上述結(jié)果提示，兔脛骨骨膜細(xì)胞具有多向分化能力。

A：ALP染色( ×100)；B：茜素紅染色( ×100)；C：油紅O染色( ×100)；D：阿爾辛藍(lán)染色( ×100)。圖2 兔脛骨骨膜細(xì)胞鑒定Fig.2 Identification of rabbit tibial periosteal cells

2.3 兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片的構(gòu)建 兔脛骨骨膜細(xì)胞用維生素C誘導(dǎo)14 d，孔板底形成透明白色膜片樣結(jié)構(gòu)，邊緣卷曲(圖3A)。顯微鏡下可見細(xì)胞排列緊密(圖3B)，用細(xì)胞刮刀輕輕地沿培養(yǎng)皿邊緣緩慢剝離膜片，可獲得完整的細(xì)胞膜片，質(zhì)地柔軟，膜片在液體中可完全舒展。

2.4 兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片組織形態(tài)學(xué)觀察 H-E染色顯示，膜片由多層細(xì)胞及豐富的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，所獲得的細(xì)胞膜片厚度較為均一，細(xì)胞與細(xì)胞間連接緊密(圖4A、B)。Masson染色顯示，胞核為褐色，膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞間可觀察到藍(lán)色的膠原纖維(圖4C、D)。

2.5 兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片活死熒光染色 細(xì)胞活死熒光染色結(jié)果顯示，兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片主要由綠色熒光的活細(xì)胞構(gòu)成，紅色熒光的死細(xì)胞較少(圖5)。

A：大體觀；B：鏡下觀( ×100)。圖3 兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片F(xiàn)ig.3 Rabbit tibial periosteal cell sheet

A、B：膜片H-E染色(A： ×100，B： ×200)；C、D：膜片Masson染色(C： ×100，D： ×200)。圖4 兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片組織形態(tài)學(xué)觀察Fig.4 Histological observation of the rabbit tibia periosteal cell sheet

A：活細(xì)胞染色；B：死細(xì)胞染色；C：活死細(xì)胞染色。圖5 兔脛骨骨膜細(xì)胞膜片活死熒光染色( ×100)Fig.5 Live-dead fluorescent staining of rabbit tibia periosteal cell sheet

3 討 論

現(xiàn)有臨床治療對炎癥、創(chuàng)傷等造成的頜面部骨缺損，多采用自體骨或異體骨移植作為常規(guī)手段。但這些方法存在諸多問題，比如自體骨的獲取可造成供區(qū)大范圍的損傷以及較大的術(shù)后反應(yīng)；異體骨移植則存在免疫排斥和傳染性疾病傳播的風(fēng)險等。細(xì)胞膜片技術(shù)可通過誘導(dǎo)自體細(xì)胞形成富含胞外基質(zhì)的膜樣結(jié)構(gòu)，無需復(fù)合支架材料即可用于組織缺損的再生修復(fù)[6-7]。鑒于細(xì)胞膜片技術(shù)在組織缺損修復(fù)再生的應(yīng)用前景，本研究通過體外分離培養(yǎng)脛骨骨膜細(xì)胞并構(gòu)建細(xì)胞膜片，再對該細(xì)胞膜片的生物活性進(jìn)行初步研究。

骨膜細(xì)胞作為頜面部骨缺損修復(fù)的種子細(xì)胞，具有極大的潛力。首先，骨膜作為骨祖細(xì)胞的來源，與骨形成有關(guān)[8]。對于頜面部骨缺損來說，骨膜細(xì)胞在生物學(xué)上與骨的形成和修復(fù)更接近，與骨再生高度相關(guān)。其次，骨膜細(xì)胞來源豐富，具有自我更新及多向分化能力[4]。本研究采用酶消化結(jié)合組織塊法成功分離培養(yǎng)兔脛骨骨膜細(xì)胞，其增殖曲線呈S型增長，具有克隆形成能力；通過成骨、成脂及成軟骨誘導(dǎo)，驗證了其具有多向分化能力。

Okano等[9]報道使用溫敏培養(yǎng)基，通過改變溫度可獲得完整的細(xì)胞膜片。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，陸續(xù)有報道多種構(gòu)建細(xì)胞膜片的方法，如羊膜基底膜法、磁力組織工程法、pH反應(yīng)系統(tǒng)法等。羊膜基底膜法是將細(xì)胞接種于羊膜上，在Transwell小室中培養(yǎng)獲取細(xì)胞膜片[10]；磁力組織工程法是將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結(jié)合磁性陽離子脂質(zhì)體添加至由親水性、中性的共價水凝膠層組成的培養(yǎng)皿表面，于培養(yǎng)皿下置磁鐵，細(xì)胞膜片形成后移去磁鐵，利用磁力分離獲得細(xì)胞膜片[11]；pH反應(yīng)系統(tǒng)法是將聚(丙烯胺鹽酸鹽)以及聚(苯乙烯磺酸鈉)層層沉積在導(dǎo)電氧化錫電極上組成培養(yǎng)基底，細(xì)胞接種于此培養(yǎng)基底上，待細(xì)胞膜片形成后，通過降低pH值獲取細(xì)胞膜片[12]。上述構(gòu)建膜片的方法由于操作較為復(fù)雜，不利于推廣應(yīng)用。而維生素C誘導(dǎo)法具有操作簡單的特點，對設(shè)備無特殊要求，所構(gòu)建的生物學(xué)性能的膜片被廣泛使用。

維生素C作為膠原脯氨酰羥化酶的輔因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)/膠原穩(wěn)態(tài)[13]。Wei等[14]利用維生素C成功誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞形成細(xì)胞膜片。Horimizu等[15]用維生素C構(gòu)建人骨膜膜片，與人富血小板纖維蛋白復(fù)合，植入裸鼠顱骨缺損中，顯示有新骨的形成。本課題組前期[16]已成功使用維生素C構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的膜片。本研究采用維生素C對兔脛骨骨膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，成功構(gòu)建了細(xì)胞膜片。H-E染色及Masson染色顯示，膜片由多層細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，膜片厚度均勻。細(xì)胞活死熒光染色結(jié)果顯示，膜片主要由綠色熒光的活細(xì)胞構(gòu)成。

本研究采用維生素C誘導(dǎo)法成功構(gòu)建了骨膜細(xì)胞膜片，為利用骨膜細(xì)胞膜片修復(fù)頜面部骨缺損提供一定的實驗依據(jù)。盡管如此，對骨膜細(xì)胞膜片形成的具體機(jī)制尚需要做進(jìn)一步分析，同時由于骨再生過程調(diào)節(jié)因素復(fù)雜，后續(xù)還將通過體內(nèi)實驗，進(jìn)一步驗證骨膜細(xì)胞膜片的成骨能力并闡明其骨再生作用機(jī)制。相信通過進(jìn)一步的研究，骨膜細(xì)胞膜片將有助于頜面部骨缺損的再生治療。