基于動物實驗和網絡藥理學研究白竭散保留灌腸治療潰瘍性結腸炎的作用機制※

趙夢月 孫曉健 王宏昌 毛細云

(安徽中醫(yī)藥大學研究生院2019級碩士研究生，安徽 合肥 230012)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及結腸黏膜(下)層，呈間斷性腹痛、腹瀉及黏液膿血便。目前，現(xiàn)代醫(yī)學治療UC雖可改善患者癥狀，但長期使用易出現(xiàn)耐藥性，復發(fā)率高且易引起變態(tài)反應等毒副作用。各類炎癥因子致結直腸黏膜及其功能損壞是導致UC發(fā)生的重要機制[1]，故修復黏膜潰瘍是治療UC的關鍵。中醫(yī)在止血和斂瘡生肌方面頗具優(yōu)勢，如中藥保留灌腸，藥物直達病灶，延長藥物與病灶接觸時間，縮短起效時長，不僅提高了生物利用度，且無明顯毒副作用。白竭散為安徽省中醫(yī)院院內制劑，可活血化瘀，止血止痛，生肌斂瘡。本研究基于動物實驗和網絡藥理學挖掘白竭散保留灌腸治療UC的作用機制。

1 白竭散治療UC實驗研究

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠42只，雌雄各半，體質量(240±20)g，購自安徽醫(yī)科大學，動物許可證號SCXK(皖)2017-001，并通過安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，實驗前適應性喂養(yǎng)7 d，自由飲食水。

1.1.2 藥品與試劑 白竭散藥物組成：白及、龍血竭。0.23 g/mL白竭散混懸液(安徽省中醫(yī)院)；美沙拉秦灌腸液[Vifor AG Zweigniederlassung Medichemie Ettingen(瑞士)，進口藥品注冊證號H20150127]；5%2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(TNBS，Sigma)；10%水合氯醛溶液(北京百奧萊博科技有限公司)，4%多聚甲醛固定液(Biosharp)；便隱血試劑盒(珠海貝索生物技術有限公司)；蘇木精、伊紅染色液(安徽中醫(yī)藥大學實驗中心)。

1.1.3 儀器 電子天平(梅特勒-托利多集團)；Olympus CX41顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將42只SD大鼠隨機抽出10只為空白組，剩余32只大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，將直徑為2 mm的橡膠軟管自大鼠肛門緩慢插入8 cm，注入5% TNBS 0.6 mL，將大鼠倒立2 min，清醒后正常喂養(yǎng)。每日觀察大鼠情況，記錄體質量、糞便及隱血情況，若出現(xiàn)體質量下降、腹瀉、膿血便，說明經過TNBS誘導的大鼠腸道已出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)，在32只大鼠中隨機抽出2只，禁食不禁水，麻醉處死，剪取距肛門約8 cm腸道，400倍顯微鏡下觀察結腸組織，見黏膜層炎癥改變，潰瘍形成，造模成功。余鼠30只按照隨機數(shù)字表法分為3組，模型組、美沙拉秦組、白竭散組，每組10只。

1.2.2 藥物干預與標本處理 造模成功后次日，按動物體表系數(shù)等效劑量法計算，白竭散組予白竭散混懸液2.3 g/(kg·d)灌腸，美沙拉秦組予美沙拉秦灌腸液0.7 g/(kg·d)灌腸，模型組、空白組予0.9%氯化鈉注射液2 mL灌腸。每日固定時間灌腸1次，連續(xù)15 d。療程結束后各組大鼠禁食不禁水24 h，麻醉處死，剪取距肛門約8 cm腸道，先在400倍顯微鏡下觀察結腸組織，再用4%多聚甲醛固定液固定48 h，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，最后放置顯微鏡，400倍下觀察HE染色后的組織切片。HE染色過程：脫蠟，覆水，蘇木精染色液染色5 min，伊紅染色液染色1～3 min(根據(jù)染色情況，適當增加或減少染色時間)，流水沖洗。

1.2.3 觀察指標及方法 ①觀察各組大鼠治療后癥狀表現(xiàn)、結腸組織損傷情況。②比較各組大鼠疾病活動指數(shù)(DAI)、結腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)評分。DIA評分[3]，0分：體質量未降，大便結實，隱血陰性；1分：體質量降低1%～5%，大便輕度松散，隱血陰性；2分：體質量降低5%～10%，大便松軟，隱血陽性；3分：體質量降低10%～15%，腹瀉、稀便，隱血陽性；4分：體質量降低>15%，腹瀉，肉眼膿血便。CMDI評分[1]，0分：無損傷；1分：局部充血水腫，無潰瘍；2分：有潰瘍，無明顯炎癥；3分：有潰瘍，1處炎癥；4分：多處潰瘍和炎癥，潰瘍<1 cm；5分：多處潰瘍和炎癥，至少有1處潰瘍>1 cm。③觀察各組大鼠結腸組織HE染色結果。

1.3 結果

1.3.1 各組大鼠治療后表現(xiàn)情況 空白組大鼠體質量無明顯變化，活動量正常，精神反應靈敏，大便質軟成形，無黏液膿血便；模型組大鼠活動量減少，體質量減輕，大便不成形，見膿血便；美沙拉秦組及白竭散組大鼠精神良好，反應尚靈敏，體質量基本正常，大便輕度松散，無黏液膿血便。

1.3.2 各組大鼠治療后結腸組織損傷情況 空白組大鼠結腸壁結構完整，無損傷；模型組大鼠結腸壁可見多處潰瘍，大小不等，直徑最大約1.1 cm，炎癥較重；美沙拉秦組及白竭散組大鼠結腸壁潰瘍面較少，面積較小，炎性反應輕。

1.3.3 各組大鼠DAI、CMDI評分比較 見表1。

表1 各組大鼠DAI、CMDI評分比較 分，

由表1可見，模型組大鼠DAI及CMDI評分均高于空白組(P<0.05)；美沙拉秦組、白竭散組大鼠DAI及CMDI評分均低于模型組(P<0.05)；美沙拉秦組與白竭散組大鼠DAI及CMDI評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.3.4 各組大鼠結腸組織HE染色結果 空白組大鼠腸壁結構完整，未見明顯炎癥細胞；模型組大鼠腸壁結構不完整，固有腺體及腺上皮杯狀細胞明顯減少，固有間質及腸壁全層可見彌漫大量炎癥細胞浸潤，血管擴張充血，黏膜下層水腫明顯，結構紊亂。美沙拉秦組及白竭散組大鼠染色結果基本一致,腸壁結構基本完整，可見部分修復，黏膜固有層水腫不明顯，可見少量炎癥細胞浸潤，固有腺體及其杯狀細胞數(shù)量較模型組增多，排列稍疏松，黏膜下層及固有肌層未見明顯炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸HE染色結果 (HE，×400)

2 白竭散治療UC的網絡藥理學分析

2.1 軟件及數(shù)據(jù)庫 中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、化源網(http://www.chemsrc.com)、Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、SwissTargetPrediction &&SwissADME(http://www.swisstargetprediction.ch)、OMIM(https://omim.org)、Therapeutic Target Database(TTD，http://db.idrblab.net/ttd)、GeneCard(https://www.genecards.org)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org)、Drugbank(https://go.drugbank.com)、UniProt(https://www.uniprot.org)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)、String(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl)，可視化網絡繪制圖軟件Cytoscape 3.7.2，專業(yè)型化學結構式編輯器King Draw V 1.2.2,微生信在線繪圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn)。

2.2 白竭散有效成分及靶點篩選 以“白及”“龍血竭”為關鍵詞，通過使用TCMSP、化源網、PubChem數(shù)據(jù)庫檢索，獲得白竭散中部分化合物的分子式，導入“SwissTargetPrediction”，獲得對應化合物的結構式，對于其他無法直接獲得化學分子式及結構式的化合物，通過文獻[4-5]查閱出該類化合物的化學結構式，使用“King Draw V1.2.2”繪制出對應的化學結構式，將所有獲取的化合物化學結構式導入“SwissADME”，研究物種選擇“人類”，以可能性≥0.12，將篩選完的成分進行靶點預測，獲得115個化合物，500個基因靶點，基于數(shù)據(jù)庫“Uniprot”，進行人類基因的名稱轉換、規(guī)范。

2.3 UC疾病靶點檢索與篩選 基于OMIM、TTD、GeneCard、PharmGK、Drugbank、UniProt、Disgenet數(shù)據(jù)庫，輸入“Ulcerative Colitis”檢索，檢索范圍為“智人”獲得人類UC基因，與靶點取交集，構建“白竭散-UC靶點Venn圖”，獲得105個交集靶點(見圖2)，獲得白竭散對應有效成分106個，見表2。

表2 白竭散有效成分

圖2 白竭散-UC靶點Venn圖

2.4 藥物-有效成分-疾病靶點網絡構建 將105個交集靶點與106個有效成分輸入Cytoscape 3.7.2獲得白竭散治療UC潛在靶點，建立“藥物-有效成分-疾病靶點”網絡圖(見圖3)。可見白竭散中同一個活性成分可以作用于多個靶點，不同的活性成分也可作用于相同靶點，充分體現(xiàn)白竭散多成分、多靶點特征。

(BJ:白及，LXJ：龍血竭)圖3 藥物-有效成分-疾病靶點網絡圖

2.5 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 將交集靶點導入String，以置信度≥0.4，得到一個105個節(jié)點、1365條邊、密度0.639的PPI網絡圖(見圖4)。以degree由大到小排序，按照degree≥2倍中位數(shù)34為標準，得到核心靶點27個，主要有蛋白激酶B1(Akt1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、白細胞介素2(IL-2)、環(huán)氧合酶2(PTGS2)、原癌基因蛋白(JUN)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、腫瘤壞死因子(TNF)等。

圖4 核心靶點PPI網絡圖

2.6 基因本體生物過程(GOBP)富集分析 采用Metascape對交集靶點進行GOBP富集分析，據(jù)P值選取前20類生物過程作圖5，可知其主要富集在炎性反應、活性氧代謝等方面。

圖5 GOBP富集分析圖

2.7 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將交集靶點進行KEGG通路富集分析，以P值、富集程度、基因數(shù)及相關研究結果作為條件，得到癌癥信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路、Janus激酶-信號轉導和轉錄激活因子(Jak-STAT)信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體 (TLR) 信號通路等25條與UC相關的信號通路(見表3)。KEGG富集分析、靶點-通路可視化，分別見圖6、7。

圖6 KEGG通路富集分析圖

圖7 靶點-通路圖

表3 KEGG通路富集分析

3 討論

UC為世界性難治性慢性疾病之一，發(fā)病率逐年上升[6]。中醫(yī)藥防治UC經驗豐富，較現(xiàn)代醫(yī)學有顯著優(yōu)勢。白竭散對局部創(chuàng)面組織中炎癥細胞有明顯抑制作用，能減輕創(chuàng)面炎性反應[6]，增加羥脯氨酸(OHP)含量，提高肉芽組織中血管內皮生長因子(VEGF)的表達，促進創(chuàng)面愈合，減輕疼痛。本實驗用白竭散對UC模型大鼠進行灌腸治療，結果顯示，白竭散治療組大鼠DIA、CMDI評分均較模型組降低(P<0.05)，且與美沙拉秦治療組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結腸組織病理狀況改善，證明白竭散可緩解UC模型大鼠的結腸黏膜損傷。

白及藥用歷史悠久，可收斂止血，消腫生肌，主要含聯(lián)芐類、菲類、聯(lián)菲類等化合物[7]。白及中黏液質在創(chuàng)面上覆蓋形成薄膜，抑制纖溶酶，增加血小板Ⅲ因子活性，形成人工血栓而止血，成為機械屏障而抗菌，同時白及多糖可抗?jié)?、抗氧化，在胃潰瘍中可通過調控Jak-STAT通路相關蛋白及氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白的表達減輕炎性反應，也可抑制PI3K、Akt 表達發(fā)揮止血作用[7-8]，此外還可增加各類氧化酶活性，有效抑制損傷腸道中TNF-α、NF-κBp65含量[9]。龍血竭可活血化瘀，止痛消腫，斂瘡止血，現(xiàn)代藥理研究證明其有抑制血栓形成、止血、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧自由基、促進表皮修復等功效，還可改善血小板激活狀態(tài)，下調TNF-α，減輕UC炎性反應，阻斷潰瘍發(fā)展[10]。黃酮類物質為其主要成分之一，鎮(zhèn)痛活血功效較強，如劍葉龍血素通過阻斷P物質的合成和釋放來抗炎鎮(zhèn)痛，龍血素A可降低血液黏度、纖維蛋白含量，改善血液流動，抑制血栓形成，這可能與PI3K-Akt信號通路有關；酚類物質其第二大類成分，有顯著抗菌消炎功效。楊天睿等[11]證實龍血竭可抑制多種自由基產生，降低氧化應激損傷，保護心肌細胞。

UC可發(fā)生癌變，其相關結腸癌(CAC)發(fā)病率較散發(fā)性結腸癌高。VEGF在UC炎性組織中高表達，進而激活血小板形成微血栓，損傷腸黏膜微循環(huán)，加劇缺氧，形成利于CAC形成的微環(huán)境，同時可激活AGE-RAGE信號通路[12]，進而誘導氧化應激反應及MAPK、NF-κB等多個信號通路。MAPK信號通路能通過級聯(lián)反應來調控UC中炎癥因子。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-Akt-mTOR)信號通路可通過影響細胞生長，促進UC炎癥及癌變進展；EGFR在UC中高表達，參與UC復發(fā)、癌變過程[13]；TNF-α可通過NF-κB信號通路誘導細胞凋亡參與免疫調節(jié)。

在UC進程中，炎性反應主要由NF-κB、Jak-STAT、MAPK、TLR等信號通路介導[14]。此外，PTGS2可調節(jié)細胞黏附性及凋亡。氨基末端激酶(C-jun)作為JUN家族中重要一員，其參與炎癥細胞整個生成及分化過程，通過JUN蛋白的表達來實現(xiàn)其功能，有研究表明JUN在UC的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用[15]。MMP-9可提高炎癥細胞穿透性，削弱結腸黏膜防御力；TNF受體阻斷劑可有效抑制促炎因子引起的腸道損傷；Akt主要通過調控細胞因子、抑制炎性反應介導UC進程；IL-2在UC中過表達[16]，可通過Jak-STAT信號通路干預炎癥進展[17]； TLR通過啟動NF-κB刺激大量炎癥因子釋放[18]。此外還有輔助性T淋巴細胞1(Th1)和Th2細胞分化、炎癥性腸病等信號通路均在UC進程中起重要作用。

UC的發(fā)病機制還與氧化應激有關[19-20]。腸道內有豐富的微生物群，對氧化應激較為敏感，生理狀態(tài)下氧化與抗氧化處于相對平衡狀態(tài)，在某些病理狀態(tài)下致前者超過后者引起氧化應激反應，引發(fā)UC。故抑制炎性反應，提高活性氧代謝，抑制氧化應激反應成為治療UC的重要方案。本研究基于網絡藥理學研究的結果顯示，白竭散可通過白及多糖、黃酮類及酚類等成分，調控Akt1、VEGFA、IL-2、PTGS2、JUN、EGFR、MMP-9、TNF等蛋白表達，干預癌癥信號通路、PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK、NF-κB、Jak-STAT、TNF、TLR等信號通路，以抑制炎性反應、提高活性氧代謝、抑制氧化應激反應來緩解UC腸黏膜損傷，與上述理論不謀而合。

綜上所述，白竭散灌腸可有效緩解UC大鼠腸黏膜損傷，其機制可能是通過白及多糖、黃酮類及酚類等成分調控相關基因和通路，抑制炎性反應和氧化應激反應,提高活性氧代謝,從而緩解UC腸黏膜損傷，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路的作用特點。