南瓜實蠅氣味結合蛋白基因鑒定及組織分布

孔 瓊，王傳銘，汪斌偉，張曉媛，李 珣，謝 昆，舒 茜，黃鏡梅，袁盛勇

(紅河學院生物科學與農學學院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南 蒙自 661199)

【研究意義】南瓜實蠅[Bactroceratau(Walker)]是一種重要的農業(yè)檢疫性害蟲，分布于東南亞和南太平洋地區(qū)[1]，而中國主要分布于東南沿海、華中、華南、西南等地區(qū)。寄主范圍廣，能危害16個科80多種植物，尤其是果蔬類作物，會造成巨大的經濟損失。目前該蟲仍以化學防治為主，帶來一系列不良后果，如環(huán)境污染加重、果蔬農藥殘留超標和害蟲易產生抗藥性等[2-4]。所以，基于嗅覺靶標的防治策略制定具有重要意義，即通過調控其覓食、產卵等行為進行害蟲防治是一個重要的研究方向，開發(fā)綠色、環(huán)保、安全的新型昆蟲行為干擾劑，并為南瓜實蠅的后期相關研究提供理論基礎。【前人研究進展】昆蟲嗅覺感受器是昆蟲感受外界揮發(fā)性化學物質的特異感受系統，昆蟲通過該系統感知和識別氣味分子，并將其轉化為電生理信號，從而調控昆蟲對外界信息化學物質做出反應，如取食、交配、產卵及躲避敵害等行為[5-6]。而這一序列過程，需要多種蛋白參與，包括氣味結合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、化學感受態(tài)蛋白(chemosensory proteins，CSPs)、氣味受體蛋白(odorant receptors，ORs)、氣味降解酶(odorant degrading esterase，ODEs) 、離子型受體(ionotropic receptors，IRs) 以及感覺神經元膜蛋白 (sensory neuron membrane proteins，SNMPs)等，且每種蛋白都不可替代，發(fā)揮著重要作用[7-8]。其中OBPs是氣味分子和受體間的橋梁，起到識別并運輸氣味分子，激活受體，降解和保護等主要功能，在昆蟲嗅覺通訊中具有重要作用[7,9]。目前，氣味結合蛋白(OBPs)在多種昆蟲中被鑒定出來，如鱗翅目稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)[10]、大蠟螟(Galleriamellonella)[11]、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)[12]；直翅目亞洲小車蝗(Oedaleusasiaticus)[13]、沙漠蝗(Schistocercagregaria)[14]；鞘翅目馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)[15]、云南切梢小蠹(Tomicusyunnanensis)[16]；膜翅目斑痣懸繭蜂(Meteoruspulchricornis)[17]；雙翅目柑橘大實蠅(Bactroceraminax)[18]、斑翅果蠅(Drosophilasuzukii)[19]；半翅目麥長管蚜(Sitobionavenae)[20]等。雖然OBPs是一類低分子量的水溶性蛋白，且具有相似的結構，但不同種昆蟲其OBPs數量和組織表達差異較大[21]?！颈狙芯壳腥朦c】前人關于實蠅科害蟲桔小實蠅(B.dorsalis)、柑橘大實蠅(B.minax)、瓜實蠅(B.cucurbitae)等的OBPs鑒定、特征、組織表達及功能研究較多[18,22-23]，而南瓜實蠅(B.tau)的相關研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過南瓜實蠅轉錄組庫和NCBI搜尋氣味蛋白基因，對南瓜實蠅OBPs基因的cDNA全長序列進行克隆和分析，并采用半定量RT-PCR檢測不同OBPs基因在其組織中的表達情況，以期明確南瓜實蠅OBPs 基因的特性、表達情況，為南瓜實蠅的后續(xù)相關研究和揭示昆蟲嗅覺反應機制提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蟲源：南瓜實蠅采用人工飼養(yǎng)3代以上的實驗室種群。成蟲于26 ℃，相對濕度(75±10)%，光周期L∶D=14 h∶10 h下進行飼養(yǎng)。

主要試劑：Trizol 購自 Invitrogen公司；通用型RNA提取試劑盒(R4130-02)購自廣州美基生物科技有限公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、載體 pMD18-T和TOP10感受態(tài)細胞購自 TaKaRa公司；反轉錄試劑盒(HB181210)、Hieff?PCR Master Mix、三氯甲烷、瓊脂糖、無水乙醇、DL2000 DNA Marker、loading buffer等一些常用試劑購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 南瓜實蠅OBP基因的克隆

1.2.1 引物設計 根據轉錄組測序結果注釋篩選獲得6條南瓜實蠅OBP基因，利用Primer premier 5.0設計擴增OBPs全長和RT-PCR的所用引物(表1)，引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 南瓜實蠅不同組織的RNA采用通用型RNA試劑盒提取，并采用反轉錄試劑盒進行cDNA合成，獲得cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?，或直接用于克隆或RT-PCR。

1.2.3 南瓜實蠅OBP基因的克隆與鑒定 以cDNA為模板進PCR擴增，克隆OBPs的全長。體系為50 μL，組成為模板cDNA 2 μL、PCR Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL，反應條件為94 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、50～58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，其中退火溫度根據引物不同進行微調。將鑒定后的擴增產物連接至pMD18-T載體，并轉化到TOP10感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后，挑起陽性單克隆菌株送至上海生工生物科技有限公司測序。測序結果利用DNASTAR 7.1軟件中的SeqMan工具進行拼接分析，獲得完整的基因編碼區(qū)序列。

1.2.4 南瓜實蠅OBPs序列分析及系統進化樹構建 利用在線程序ExPASy ProtParam獲得OBPs編碼氨基酸的數量、分子量、等電點等信息；再通過在線程序Open Reading Frame Finder預測OBPs序列的開放閱讀框；用Vector NTI計算序列間的相似度；同時用SignalP 4.1在線軟件進行信號肽預測；采用TMHMM工具分析蛋白質跨膜區(qū)；運用NCBI中的BLAST工具進行序列相似性搜索；采用MEGA 6.0軟件的neighbor-joining(NJ)法(Bootsrap1000次)進行系統進化分析。

表1 南瓜實蠅OBPs 基因鑒定和組織表達分布所用引物

1.3 南瓜實蠅雌、雄蟲中OBPs的組織表達分析

以南瓜實蠅雌、雄蟲不同組織的cDNA為模板，β-actin為內參照基因，用表1中的半定量特異性引物進行擴增。反應體系(體積50 μL)為模板cDNA 2 μL、PCR Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL；反應程序為94 ℃ 預變性5 min、94 ℃變性30 s、50～57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶。

2 結果與分析

2.1 南瓜實蠅OBPs克隆

用設計的6對特異性全長引物對南瓜實蠅OBP基因編碼區(qū)進行擴增，獲得大小為500～990 bp，與預測相符(圖1)，可用于后續(xù)試驗。

2.2 南瓜實蠅OBPs序列分析和鑒定

根據6對引物的特異性擴增和測序拼接后的序列，并利用 OBPs 保守半胱氨酸(Cys，cysteine)位點的特征序列鑒定南瓜實蠅OBPs，再利用 PSI-Blast 和關鍵詞搜索進行比對鑒定，共獲得6個OBPs，見表2。6個OBPs基因序列長度在498～955 bp，編碼的氨基酸數量為128～314 aa，等電點于4.69～8.16，分子量大小為14.67～36.24 kDa，且每個OBP序列的N端均有具有16～26 aa組成的信號肽序列。其中OBP1編碼314個氨基酸為超長鏈，相比其他的OBPs要長149～223 aa，而OBP2、OBP9、OBP11和OBP14為長鏈，編碼的氨基酸分別為165、154、148和148個，OBP8則為中鏈，編碼128 aa。

同時根據OBPs保守Cys殘基數目和多序列比對發(fā)現南瓜實蠅OBPs具有典型的保守結構域，其中OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14等5個屬于Classica型，均含有6個保守半胱氨酸位點；而OBP8的第2、5個保守半胱氨酸位點被其他氨基酸代替，在分類上屬于Minus型(圖2)。

2.3 南瓜實蠅OBPs的進化分析

通過南瓜實蠅6個OBPs序列間的相似度對比發(fā)現，不同序列間的相似性較低為30%～51%(表3)。其中OBP8和OBP9的氨基酸序列相似性最高達51%；OBP11和OBP14次之，為49%；OBP2和OBP9、OBP8和OBP11較低為40%；OBP1和OBP11的相似性最低為30%，表明6個南瓜實蠅OBPs在一定程度上具有同源性，也存在著較強的分化差異。

表2 南瓜實蠅OBPs基因序列分析

表3 南瓜實蠅6個OBP氨基酸序列的相似性

為了明確南瓜實蠅OBP與其他近緣種的進化關系，以南瓜實蠅OBPs氨基酸序列進行BLAST比對，并選取比對結果相似性大于70%且與南瓜實蠅OBPs相近的12種雙翅目實蠅科昆蟲共48個OBPs進行系統進化樹構建(圖3)。由圖3可知，6個南瓜實蠅OBP分布在其他實蠅科昆蟲的OBPs分枝上，沒有特化形成單一分枝。其中OBP1、OBP2、OBP14聚于同一大進化分枝，又分別聚于不同的小進化枝(OBP1、OBP2聚于同一進化枝，OBP14單獨為另一枝)，3個均為Classic型；OBP11單獨分布在另一進化枝上，屬于Classic 型；而OBP8、OBP9聚類在同一大類的進化分枝上，但是又分別聚于不同小進化枝上，且OBP9是Classic型，而OBP8是Minus型，結果表明它們之間具有一定的同源性，但又存在分化。與其他雙翅目昆蟲比對發(fā)現，6個南瓜實蠅OBPs與瓜實蠅(Zeugodacuscucurbitae)的OBPs親緣關系較近，柑橘大實蠅(B.minax)次之；雖然不同OBPs之間分化程度明顯，但相同OBPs亞家族仍然聚類到同一進化枝，表明其在進化過程中仍具有同源性。

2.4 南瓜實蠅雌、雄蟲中OBPs的組織表達情況

采用半定量PCR對6個OBPs基因在南瓜實蠅的不同性別、成蟲不同組織中的表達情況進行檢測，從圖4可看出，除OBP14在雄蟲腹部組織不表達，且在雌蟲頭、足和腹部表達較少外，其余5個OBPs在雌、雄蟲的不同組織中均有分布和表達。其中OBP1在雌雄蟲的不同組織中均有表達和分布且表達量相對一致，OBP2在雄蟲的觸角、頭、足和腹部組織中表達量相對較高且一致，而OBP8則在雌蟲的觸角、頭、足和腹部組織中高度表達且量相對一致。因此OBP1、OBP2、OBP8、OBP9、OBP11 5個OBPs在雌、雄蟲的觸角、頭、足和腹部等組織中廣泛分布，而OBP11、OBP14均在雌、雄蟲觸角中高度表達。

3 討 論

前人研究發(fā)現昆蟲OBPs是一類水溶性的小分子蛋白，不同昆蟲其體內鑒定出的數目多少不等且差異較大，不同屬或種間其氨基酸序列差異較大，并且同一物種下不同OBP間的氨基酸同源性也較低[21,24-25]。如鞘翅目馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)鑒定出26個OBP，編碼氨基酸長度為67～255 aa，各序列間高度分化，氨基酸序列相似性為3.20%～41.91%[15]；雙翅目中的桔小實蠅(B.dorsalis)鑒定出49個OBP[26]；棗實蠅(Carpomyavesuviana)克隆出7個OBP，其開發(fā)閱讀框長為372～510 bp，編碼氨基酸長度為124～170 aa[27]；福建漳州的南亞實蠅(B.tau，南瓜實蠅)克隆鑒定出26個OBP[28]，且與瓜實蠅(B.cucuribitae)OBPs高度相似；而云南紅河州的南瓜實蠅(B.tau)僅克隆鑒定出6個OBP，其編碼的氨基酸長度為128～314 aa，各序列間高度特化，氨基酸序列相似性僅為3.20%～41.91%，并且不同OBP間其相似性較低為30%～51%，可能與采集地地理環(huán)境不同或者未完全鑒定出OBP有關，推測南瓜實蠅體內不同OBPs可能具有不同的生理功能。

根據OBPs中半胱氨酸殘基位置和數目的不同，可將昆蟲OBPs分為5類：①Classical，含有6個保守的半胱氨酸位點;②Minus，常含有4或5個半胱氨酸位點，其數目比Classical型少1～2個;③Plus，保守半胱氨酸數量大于6個，在第6個半胱氨酸后至少有2個額外的半胱氨酸和1個脯氨酸;④Atypical，含有多于6個半胱氨酸位點，但N端區(qū)域較為典型，C端區(qū)域較長且特征不明顯;⑤Dimer，含有2個典型的半胱氨酸基序聚合在一起形成[25,29-31]。通過試驗鑒定出的6個南瓜實蠅OBPs，有5個是Classical型，分別為OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14，均含有6個保守半胱氨酸位點；1個(OBP8)是Minus型，該基因的第2個、第5個保守半胱氨酸位點被其他氨基酸代替。南亞實蠅(B.tau，南瓜實蠅)鑒定出的26個OBPs中Classical型有21個，Dimer型1個，Minus型和Plus型各2個[28]；桔小實蠅(B.dorsalis)注釋獲得49個OBPs，其中33個屬于Classical型，4個屬于Plus，10個屬于Minus，僅有2個屬于Atypical型[26]；棗實蠅(Carpomyavesuviana)轉錄組獲得7個OBPs，其中5個是Classical型，其余2個是Minus型[27]。因此不同科屬或同屬不同種的昆蟲體內的OBPs數目、類型和比例差異較大。OBPs可在昆蟲的不同組織中表達，如頭、胸、腹、翅、下顎須、喙、口器、性腺、精囊、氣門等[21]，同時在昆蟲的唾液中也有表達[31]。但同種昆蟲OBP在不同性別的成蟲組織中表達量差異較大[9,21]，本文研究也有類似的結果，即南瓜實蠅(B.tau)的5個OBP1、OBP2、OBP8、OBP9、OBP11在雌、雄蟲的觸角、頭、足和腹部等組織中廣泛分布，而OBP14在雌蟲的腹部不表達，因此腹部可能不是南瓜實蠅氣味結合蛋白作用的重要部位。

通過鑒定獲得6個南瓜實蠅OBP及其相關的生物信息學數據，但這些基因在蟲體內的作用，還需進一步進行表達和純化，并采用熒光競爭結合、免疫組學、亞細胞定位及RNA沉默[32]等試驗對OBP的具體功能深入研究，才能為開發(fā)南瓜實蠅綠色、有效引誘劑提供科學依據，同時為后期研究南瓜實蠅的嗅覺功能提供理論基礎。

4 結 論

克隆并鑒定出的6個南瓜實蠅OBPs基因，長度介于498～955 bp，編碼128～314 aa，其中OBP1、OBP2、OBP9、OBP11和OBP14屬于Classic型，而OBP8屬于Minus型，且6個OBPs分化明顯，相似度為30%～51%；6個OBPs在雌、雄蟲不同組織中均有表達，而OBP14在雄蟲腹部不表達，OBP15在雌蟲腹部不表達。數據的獲得將為進一步研究南瓜實蠅嗅覺識別分子機制和引誘機制奠定基礎。