貝殼杉烯酸誘導煙草的系統(tǒng)獲得性抗性防御番茄斑萎病毒侵染

趙立華，楊婷婷,2，邱潤霜，何思潔,2，余 萍，鄭 雪，張麗珍，張仲凱*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650205；2.西南林業(yè)大學園林園藝學院，云南 昆明 650224)

【研究意義】番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生分布，為害多種作物引起嚴重的經(jīng)濟損失，因其經(jīng)濟重要性和科學重要性被列為世界十大病毒之第2位[1]。TSWV近年來已在中國18個省(區(qū)、市)快速發(fā)生蔓延，嚴重危害番茄、辣椒、煙草、萵苣、葫蘆科等作物。1997年，根據(jù)感病植株葉部組織的電子顯微鏡觀察，在云南煙草中首次發(fā)現(xiàn)了疑似TSWV的病毒粒體;2010年，基于核殼體蛋白N基因測序及其推導的氨基酸序列分析正式報道云南煙草中發(fā)現(xiàn)TSWV[2-3]。TSWV是正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)的代表種，屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)，其中Orthotospovirus是唯一侵染植物的屬[4]。TSWV通過薊馬傳播，且能在薊馬體內(nèi)復制增殖，西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)是中國云南TSWV的主要傳播介體[5]。TSWV是目前已知寄主范圍最廣的植物病毒，侵染番茄(Solanumlycopersicum)、煙草(Nicotianatabacum)、辣椒(Capsicumannuum)、南瓜(Cucurbitamoschata)、芹菜(Celerycoriandrumsativum)和豇豆(Vignaunguiculata)等84科1000多種植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[6-11]。由于抗病品種缺乏與病毒突變、重組產(chǎn)生新株系等原因，目前對TSWV引起的病害尚無特效的防控方法，生物源抗病毒誘導劑是近年來病毒病防控的重要途徑之一。筆者擬在前期研究基礎(chǔ)上探明貝殼杉烯酸(Kaurenic acid,3α-Angeloyloxy-9β-hydroxy-ent-kaur-16-en-19-oil acid,AHK)對TSWV侵染煙草誘導系統(tǒng)獲得抗性的抑制機制，為生物源抗病毒農(nóng)藥研發(fā)篩選先導化合物?！厩叭搜芯窟M展】決明子(Cassiaobtusifolia)中分離的酚類化合物、腫柄菊(TithoniadiversifoliaA.Gray)中提取的倍半萜類化合物Tagitinin C和1β-methoxydiversifolin-3-0-methyl ether、桂皮(Cortexcinnamomi)、石蒜(Lycorischinensistraub)和百部(Stemonajaponica)中分離的生物堿類、石斛(Dendrobiumnobile)中分離的多糖等多種活性化合物具有抑制煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)侵染的活性[12-17]。三裂蟛蜞菊中提取的桉烷內(nèi)脂類和二萜類化合物能通過提高PAL等生物防御酶活性抵御TMV侵染[18]。腫柄菊中提取的倍半萜類化合物Tagitinin A和三裂葉蟛蜞菊(Wedeliatrilobata)中提取的AHK能通過誘導JA通路抑制TSWV侵染[16,19-20]。其中，AHK在對TSWV接種煙草前后處理均有抑制效果，抑制率分別為62.40%、76.50%，超過對照農(nóng)藥寧南霉素[20]?！颈狙芯壳腥朦c】通過AHK在TSWV接種烤煙品種K326(Nicotianatobacumcv K326)前、后處理，檢測與系統(tǒng)抗性相關(guān)的酶活性與代謝通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的表達量，探索AHK誘導寄主植物對TSWV侵染的抑制機制。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確AHK誘導寄主植物系統(tǒng)獲得抗性抑制TSWV侵染的關(guān)鍵酶及其活性變化以及主要代謝通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，為揭示其防御機理、研發(fā)生物源抗病毒誘導劑積累基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通煙烤煙主栽品種K326和TSWV毒源(TSWV-YN)，由云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所植物病毒實驗室保存?；衔镓悮ど枷┧?AHK)，由中國科學院昆明植物研究所李順林研究員提供。二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)購自SbaseBio生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 防控實驗 選擇生長一致的5～6葉期健康煙苗，先摩擦接種 TSWV，10 min后用清水沖洗，24 h后再均勻涂抹AHK (200 μg/mL)，10 min后用清水沖洗；陽性對照為先摩擦接種 TSWV，24 h后涂抹雙蒸水(ddH2O)；陰性對照為先涂抹ddH2O，24 h后涂DMSO。實驗樣品設(shè)3個重復，實驗重復3次。

1.2.2 預防實驗 選擇生長一致的5～6葉期健康煙苗，先均勻涂抹化合物AHK(200 μg/mL)，10 min后用清水沖洗，6 h后摩擦接種 TSWV，10 min后用清水沖洗；陽性對照為先涂抹ddH2O，6 h后接種TSWV；陰性對照為先涂抹ddH2O，6 h后涂抹二甲基亞楓(DMSO)。實驗樣品設(shè)3個重復，實驗重復3次。

1.2.3 煙草抗病性相關(guān)的關(guān)鍵酶活性測定 選擇生長一致的5～6葉期健康煙苗，分別進行預防實驗和防控實驗，于0、1、2、3、4和5 d采取接種葉樣品進行檢測。按照試劑盒說明書(北京索萊寶科技有限公司，中國)分別提取苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)和SOD，用分光光度計測定PAL、POD 和SOD分別在290 、470和 560 nm的吸光值(OD值)，按照試劑盒所給公式計算酶活。每組樣品設(shè)置5個重復。

1.2.4 煙草防御相關(guān)蛋白基因的實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR) 檢測寄主相關(guān)防御基因復制量變化。根據(jù)試劑盒TriPure Isolation Reagent (Roche Diagnostics GmbH公司，美國)的說明從煙葉中提取總 RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金公司)的操作將上述提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄完成第1鏈 cDNA 的合成，RT-qPCR檢測按照FastStart Universal SYBR Green Master(Box)(Roche Diagnostics GmbH公司,美國)設(shè)定反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。本研究用到的引物列于表1。用含有相應(yīng)基因序列的質(zhì)粒 DNA 建立標準線，按照10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋標準樣品。

表1 用于煙草防御相關(guān)蛋白基因的RT-qPCR檢測引物

2 結(jié)果與分析

2.1 AHK對抗病相關(guān)酶活性的影響

2.1.1 AHK對PAL活性的影響 單一AHK處理可以誘導煙草PAL酶活性升高，在處理后第1和3天活性達到高峰(圖1-A，1-B)，在防控作用(TSWV+AHK)和預防作用(AHK+TSWV)中PAL活力在第2天達到高峰。TSWV+AHK處理后到第4天PAL活力一直低于AHK處理，在陽性對照(只涂抹TSWV)和空白對照(只涂抹DMSO)中PAL活性低于AHK和TSWV+AHK處理(圖1-B)，結(jié)果表明AHK本身能誘導PAL活性升高，但只在預防作用中抵御TSWV侵染起到一定的作用。

2.1.2 AHK對POD活性的影響 AHK可以誘導過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性升高，在防控作用(TSWV+AHK)和預防作用(AHK+TSWV)中POD活力雖然有所升高，但低于對照AHK處理，陽性對照(只涂抹TSWV)和空白對照(只涂抹DMSO)中POD活力處于低水平狀態(tài)(圖1-C，1-D)，結(jié)果表明AHK本身能誘導POD活性升高，但在預防作用和防控作用中抵御TSWV侵染時未起到明顯作用。

2.1.3 AHK對SOD活性的影響 AHK可以誘導超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)在處理后第1和4天活性達到高峰，在防控作用(TSWV+AHK)和預防作用(AHK+TSWV)中SOD活力在第2天達到高峰且SOD活力高于AHK處理，在陽性對照(只涂抹TSWV)和空白對照(只涂抹DMSO)中SOD活性低于AHK、TSWV+AHK及AHK+TSWV處理(圖1-E，1-F)，結(jié)果表明AHK本身能誘導PAL活性升高，且在預防作用和防控作用中抵御TSWV侵染起到積極作用。

2.2 AHK對誘導SAR轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵基因表達量的影響

2.2.1 AHK對接種葉中相關(guān)基因表達量的影響 采用熒光定量RT-qPCR方法測定PR1a、PR1b、MYC2、NAC4個基因在接種葉中表達量。陰性對照(DMSO)的PR1a基因在0.5 h表達量達到高峰(圖2-A)，對照(DMSO)的PR1b、NAC基因在1 h表達量達到高峰，AHK處理和陽性對照(TSWV)接種葉中PR1a、PR1b、NAC基因表達量低于陰性對照(DMSO)(圖2-B，2-D)。AHK處理后MYC2基因表達量在1 h達到高峰，陽性對照(TSWV)和陰性對照(DMSO)中MYC2基因表達量一直處于低水平狀態(tài)(圖2-C)。結(jié)果表明AHK在接種葉中主要誘導了MYC2基因表達量升高。

2.2.2 AHK對接種葉中相關(guān)基因表達量的影響 系統(tǒng)葉(接種葉上一葉)中防御基因表達量的變化能進一步說明AHK通過誘導寄主的系統(tǒng)抗性抵御TSWV侵染。采用熒光定量RT-qPCR方法測定PR1a、PR1b、MYC2和NAC4個基因在接種葉中的表達量。AHK處理后PR1a、PR1b分別在第3和2小時達到高峰，且高于陽性對照(TSWV)和陰性對照(DMSO)(圖3-A，3-B)。AHK處理后MYC2基因表達量在第3小時到達高峰，且高于陽性對照(TSWV)和陰性對照(DMSO)(圖3-C)。NAC基因在AHK處理和陰性對照(DMSO)中表達量在第3小時達到高峰，但是DMSO中NAC基因表達量高于AHK處理(圖3-D)。結(jié)果說明AHK不僅誘導接種葉中MYC2基因表達量升高，同時也誘導系統(tǒng)葉中MYC2基因表達量升高，MYC2是茉莉酸(Jasmonic acid，JA)信號通路的關(guān)鍵基因，因此AHK可能通過誘導JA通路抵御TSWV侵染。

3 討 論

3.1 天然產(chǎn)物誘導寄主植物酶活性增加對系統(tǒng)獲得抗性增強的效應(yīng)

在抵御病原微生物侵染的過程中PAL、POD 和 SOD 等生物防御酶發(fā)揮著重要作用。PAL 是苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶，能誘導作物的獲得性系統(tǒng)抗性(Systemic acquired resistance,SAR)抵御病原微生物侵染[21]，POD可以催化H2O2還原，誘導SA、木質(zhì)素和抗毒素的合成，引起植物的免疫應(yīng)答，抑制病原菌的增殖[22]。SOD是生物體抗氧化系統(tǒng)第一道防線，能有效清除生物體內(nèi)活性氧[23]。前人研究發(fā)現(xiàn)生物堿化合物、香菇多糖硫酸酯、硫脲化合物、桉葉內(nèi)脂類化合物能通過提高寄主體內(nèi)PAL、POD、SOD活性，增強植物對TMV的抵御能力[15,24-27]。本研究發(fā)現(xiàn)活性化合物AHK在防控作用和預防作用中主要誘導SOD活性升高，以此增強清除活性氧的能力，同時調(diào)節(jié)植物體內(nèi)光合作用、呼吸作用等生理活動，誘導植物系統(tǒng)抗性抵御TSWV的侵染。

3.2 天然產(chǎn)物誘導寄主植物SA和JA信號通路對防御病毒侵染的抑制效果

病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后產(chǎn)生的一系列蛋白，通過誘導寄主的SAR有效抑制病原體的生長、繁殖和擴散[28-29]，研究表明PR蛋白家族中PR1與植物的SAR相關(guān)[30-32]。TSWV侵染能通過誘導寄主SA通路增強作物的基礎(chǔ)抗性，本研究中發(fā)現(xiàn)TSWV侵染誘導了寄主SA通路關(guān)鍵基因PR1a和PR1b基因的表達，與前期研究結(jié)果一致[33]。NAC代表了一大類植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，這些因子與生物的發(fā)育、衰老和防御相關(guān)，并且NAC轉(zhuǎn)錄因子參與JA信號通路[34-37]。本研究中NAC表達量有一定升高，說明NAC在化合物AHK誘導寄主抗性抵御TSWV侵染的過程中起到一定輔助作用。MYC2是JA通路的轉(zhuǎn)錄因子，MYC2轉(zhuǎn)錄因子與JAZ蛋白以及COI1基因通過ZIM結(jié)構(gòu)域相互作用，當JA通路激活時，JAZ蛋白被26S蛋白酶體降解進而釋放MYC2等轉(zhuǎn)錄因子使JA通路發(fā)揮作用[38]。本研究中AHK處理后接種葉和系統(tǒng)葉中都MYC2表達量相比于對照升高，AHK通過誘導SOD活性升高以及抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達量升高進而誘導寄主系統(tǒng)抗性抑制TSWV侵染，研究結(jié)果對研發(fā)新型抗病毒植物源藥劑，實現(xiàn)病毒病的綠色防控奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

AHK與TSWV共同作用，促進了寄主植物煙草SOD活性增強，同時通過誘導JA信號通路關(guān)鍵酶基因MYC2的高效表達增強了煙草植株對TSWV侵染的防御能力。AHK具有開發(fā)為生物源抗病毒誘導劑應(yīng)用于TSWV引起的病害的綠色防控的潛力。