堿蓬內(nèi)生菌EF0801對感染稻瘟病水稻幼苗抗氧化酶及葉綠素熒光的影響

單 羽，任曉寧，姚禹希，李 鑫，李雪梅

(沈陽師范大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110034)

【研究意義】稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)引起的水稻真菌性病害，是最具毀滅性的水稻病害之一，該病可在短時間大面積爆發(fā)，使其嚴重減產(chǎn)，甚至絕收[1]。全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失約為總量的10%～30%，它可以養(yǎng)活至少6000萬人，經(jīng)濟價值高達660億美元[2]。因此對于稻瘟病的防治也是重中之重，通過堿蓬內(nèi)生菌EF0801侵染水稻，研究內(nèi)生菌侵染是否能夠誘導水稻增強對稻瘟病菌的抵抗能力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】水稻在受到稻瘟病菌感染時，其葉綠素含量逐漸降低[3]。葉綠素熒光作為一種非侵入性且非破壞性的方法，可以更好地了解病原體感染過程中光合作用的變化。在宿主-病原體互作過程中，小麥[4-5]、水稻[6]、玉米[7]、大豆[8]的葉綠素熒光參數(shù)會發(fā)生變化。通常，病原體感染的植物葉片有效PSII量子效率下降，受調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)量的增加以及最大PSII量子產(chǎn)量的下降[9]。另外，植物在正常狀態(tài)下由于防御酶(如SOD、CAT和POD)等活性氧清除系統(tǒng)的存在而使體內(nèi)活性氧處于動態(tài)平衡[10]。當植物處于脅迫條件下(如病原體感染)會使活性氧增加[11-12]。因此，有效的清除活性氧，可以避免由于膜脂過氧化和破壞大分子對植物細胞產(chǎn)生不可逆的氧化損傷。Eberhard等[13]研究發(fā)現(xiàn)在接種稻瘟病后，水稻葉片POD活性快速上升，POD活性與抗瘟性呈正相關，活性增強有利于水稻對稻瘟病的抗性?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，內(nèi)生菌的研究成為了國內(nèi)外研究的熱點。植物內(nèi)生菌是指全部階段或部分階段生活在健康的植物細胞內(nèi)或細胞間隙的微生物資源[14]。越來越多的數(shù)據(jù)表明，內(nèi)生真菌會增加宿主植物對生物和非生物脅迫的耐受性[15-17]。Shabanamol等[18]從水稻中分離出一株內(nèi)生固氮芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)，可以誘導水稻產(chǎn)生更多的防御酶，減輕紋枯病的危害。深色有隔內(nèi)生真菌(DSE)可以通過降低水稻植株中氧化應激反應和抗氧化酶的活性從而保護水稻細胞免受氧化損害，進而增強水稻在缺水條件下的耐受性[19]。研究堿蓬內(nèi)生菌(EF0801)與水稻互作關系及作用機理具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用5%的堿蓬內(nèi)生菌(EF0801)菌懸液對未感染及感染稻瘟病菌的水稻進行處理。測定其處理7 d后的形態(tài)指標、葉綠素含量、葉綠素熒光參數(shù)及抗氧化酶活性的變化。探討內(nèi)生菌侵染是否能夠誘導水稻對稻瘟病菌的抵抗能力，以期為提高水稻稻瘟病抗性提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻(OryzasativaL.)品種為遼星1號。將精選的水稻種子置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗下28 ℃浸種24 h后30 ℃催芽24 h。將露白種子均勻地鋪滿盛有完全營養(yǎng)液(Hoagland)的燒杯(覆蓋紗網(wǎng))上進行水培。在人工氣候培養(yǎng)箱(晝夜溫度28 ℃/26 ℃；光照16 h；80%相對濕度；光強3000 lx)培養(yǎng)，每天適時適量的補充Hoagland完全營養(yǎng)液。待水稻幼苗長至2葉1心期進行處理。

堿蓬內(nèi)生菌EF0801為沈陽師范大學微生物教研室篩選獲得。將EF0801菌株轉接到PDA液體培養(yǎng)基中，在恒溫搖床上120 r/min，24 ℃培養(yǎng)10 d。用攪拌機將菌球打碎，菌懸液備用。

稻瘟病病菌由沈陽農(nóng)業(yè)大學提供。參照李元等[28]的方法，將稻瘟病菌菌絲移至產(chǎn)孢培養(yǎng)基，在26 ℃、10 h/d光照培養(yǎng)8～10 d，將孢子懸浮液濃度調(diào)至約3×105(孢子)/mL作為苗期噴霧接種體。

1.2 處理方法

選取長勢相同的2葉1心期水稻幼苗分為4組進行處理。對照組(CK)：整個實驗期間均使用完全營養(yǎng)液進行培養(yǎng)；內(nèi)生菌侵染組(E)：將5%的堿蓬內(nèi)生菌EF0801菌懸液加入到完全營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)；稻瘟病病菌感染組(RB)：將稻瘟病菌孢子液噴灑至水稻幼苗葉片上，直到剛好有水珠為止；稻瘟病和內(nèi)生菌處理組(RB+E)：將5%的堿蓬內(nèi)生菌EF0801菌懸液加入到完全營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在第2 天將稻瘟病菌孢子液噴灑至水稻幼苗葉片上。處理7 d后，測定水稻的相關指標，每個處理重復3次。

1.3 測定指標

1.3.1 形態(tài)指標的測定 選取10株幼苗，分別測定株高、根長、鮮重和干重。

1.3.2 葉綠素含量、防御酶活性以及丙二醛(MDA)含量的測定 參照李小方和張志良[22]的方法并加以改良，測定Chla、Chlb、類胡蘿卜素(Cars)含量、防御酶SOD、POD和CAT活性以及MDA含量。

1.3.3 葉綠素熒光參數(shù)的測定 選擇長勢相同的幼苗，使用連續(xù)激發(fā)式熒光儀Pocket PEA測定。測定時間為10:00—14:00，測定前對葉片進行暗處理20 min。在OJIP曲線測定中，誘導光強度設為3000 μmol/(m2·s)脈沖紅光，從10 μs開始記錄相對熒光強度，其中OJIP曲線上0.02、2、30和1000 μs對應的點分別為O、J、I、P，最后利用平均值繪制OJIP曲線，本實驗主要研究不同處理條件下，K點和L點的相對熒光強度以及相關參數(shù)的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件，通過平均值和方差分析(ANOVA)和LSD檢測，比較其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生菌侵染對感染稻瘟病菌水稻幼苗生長的影響

株高和根長可直接反映出植物的生長情況，同時生物量也是反映植物生長的一個非常有效的指標。由圖1可知，經(jīng)過E處理的水稻幼苗株高、鮮重和干重顯著高于CK組。經(jīng)過RB處理的水稻幼苗與CK組相比較，根長及鮮重有顯著性升高，但株高和干重無變化。而經(jīng)過RB+E復合處理與RB處理相比株高和干重顯著升高。

2.2 內(nèi)生菌侵染對感染稻瘟病水稻幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素是在光合作用中參與吸收、傳遞光能或引起原初光化學反應的色素，其含量直接影響植物的光合能力。經(jīng)過E處理的水稻幼苗Chla含量顯著增加(圖2-A)。RB處理則顯著降低Chlb含量(圖2-B)。而RB+E處理與RB處理相比，Cars含量顯著升高(圖2-C)。

2.3 內(nèi)生菌侵染對感染稻瘟病水稻幼苗熒光誘導動力學的影響

2.3.1 對水稻幼苗熒光動力曲線OJIP、ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的影響 葉綠素熒光誘導動力學曲線是綠色植物經(jīng)過暗適應，突然暴露在強光下以后，植物產(chǎn)生的一條熒光曲線，通常產(chǎn)生O、J、I、P 4個特征點。熒光誘導(O-J-I-P)呈現(xiàn)典型的多相上升，表明所有葉片樣品都具有光合特性(圖3-A)。對O-P相的熒光參數(shù)進行標準化，經(jīng)過RB處理的水稻幼苗其ΔVOP值大于零，而E和E+RB處理組其ΔVOP值小于零(圖3-B)。同時對O點(50 μs)和K點(300 μs)及O點和J點(2 ms)的熒光數(shù)據(jù)進行動力學曲線繪圖，經(jīng)過RB處理的水稻幼苗ΔVOK、ΔVOJ值均大于零，而經(jīng)過E和E+RB組處理的水稻幼苗其ΔVOK、ΔVOJ值均小于零(圖3-B，3-C)。ΔVOP>0，說明放氧復合體的活性低；ΔVOK>0，說明類囊體之間的能量傳遞受阻，如果ΔVOK≤0，說明光合膜系統(tǒng)完整，能量傳遞順暢；ΔVOJ越大，說明放氧復合體受到的傷害越嚴重。由此說明水稻葉片光合膜系統(tǒng)完整、能量傳遞、放氧復合體活性均優(yōu)于RB組(圖3-B、3-C、3-D)，堿蓬內(nèi)生菌EF0801可以有效地減緩稻瘟病菌對水稻幼苗光PSⅡ的傷害。

2.3.2 對水稻幼苗性能指數(shù)的影響 與CK相比較，經(jīng)過RB脅迫后，以單位面積為基礎的性能指數(shù)(PI)有顯著性的下降，而經(jīng)過E和RB+E處理的有顯著性的提高(圖4-A)。與CK相比較，經(jīng)過E處理的水稻幼苗葉片以光能吸收為基礎的性能指數(shù)(PIABS)顯著增加，而經(jīng)過RB處理后則顯著下降，經(jīng)過E+RB處理后的有一定程度下降，但與RB相比較有顯著性的增加(圖4-B)。

2.3.3 對水稻幼苗量子效率的影響 不同處理后用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φEo)、用于熱耗散的量子比率(φDo)和最大光化學效率(φPo)變化情況。經(jīng)過E處理的水稻幼苗與CK組相比，φEo顯著提高(圖5-A)，而經(jīng)過RB處理的水稻幼苗φEo和φPo顯著降低(圖5-A、5-C)，且其φDo與CK組相比顯著提高；經(jīng)過RB+E處理的水稻幼苗與RB組相比，其φEo和φPo顯著提高，且φDo顯著降低(圖5-B)。表明內(nèi)生菌侵染能夠提高稻瘟病菌感染后用于電子傳遞的量子產(chǎn)額和最大光化學效率，降低用于熱耗散的量子比率，提高光合效率。

2.3.4 對水稻幼苗比活性參數(shù)的影響 PSⅡ比活性參數(shù)包括單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)、單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC)以及單位反應中心耗散掉的能量(DIo/RC)。由圖6顯示，經(jīng)過E處理的水稻幼苗與CK組相比ABS/RC和TRo/RC無顯著變化，DIo/RC顯著降低，而經(jīng)過RB處理的水稻幼苗3種比活性參數(shù)均顯著增加，但經(jīng)過RB+E處理的水稻幼苗顯著降低。

2.4 內(nèi)生菌侵染對感染稻瘟病菌水稻幼苗葉片防御酶活性的影響

如圖7所示，經(jīng)過E處理的水稻幼苗中SOD、POD、CAT活性均顯著升高，而經(jīng)過RB處理均無顯著性差異。將RB+E處理組與RB組進行對比，RB+E組中POD、CAT活性顯著升高。

2.5 內(nèi)生菌對感染稻瘟病水稻幼苗葉片MDA含量的影響

如圖8所示，經(jīng)過E處理的水稻幼苗MDA含量顯著降低，RB處理的水稻幼苗無顯著變化。經(jīng)過RB+E處理的水稻幼苗MDA顯著低于CK。內(nèi)生菌侵染水稻幼苗對幼苗葉片膜質(zhì)過氧化有一定的緩解作用。

3 討 論

通過本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌顯著提高水稻的防御酶活性，可以有效降低水稻膜脂過氧化作用，減小細胞膜的損傷，提高Chla含量。

在本研究中，稻瘟病菌感染水稻雖未引起顯著膜脂過氧化和防御酶活性的改變，但從熒光動力學方面可以看出，感染稻瘟病菌水稻的PSⅡ已經(jīng)受到破壞，其ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的數(shù)值明顯大于零，說明稻瘟病菌抑制了放氧復合體的活性，從而導致類囊體發(fā)生解離，抑制了PSⅡ的光化學活性。然而加入內(nèi)生菌后感染稻瘟病菌的水稻幼苗ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的數(shù)值均下降，這可能是內(nèi)生菌抑制了稻瘟病對PSⅡ的光化學活性的影響，使植物水稻光合作用正常進行。張興華等[23]通過對葉綠素熒光誘導動力曲線分析認為干旱脅迫導致玉米光PSⅡ放氧復合體受到抑制。除此之外，被稻瘟病菌感染的水稻幼苗Chlb顯著降低，但內(nèi)生菌能夠提高感染稻瘟病菌水稻的Chla和Cars含量。在龔娜等[24]研究中，也發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌提取物拌種，會提高干旱脅迫下玉米苗期的葉綠素含量，增強光合能力。此外，PIABS可以準確反映植物光合機構的整體狀態(tài)[25]。RB+E組的PIABS值顯著高于RB組，說明內(nèi)生菌處理可以提高水稻葉片對光能利用。用內(nèi)生菌處理感染稻瘟病菌的幼苗，其φEo和φPo顯著升高，而φDo顯著下降，表明內(nèi)生菌侵染能夠提高稻瘟病菌感染后用于電子傳遞的量子產(chǎn)額和最大光化學效率，降低用于熱耗散的量子比率，提高光合效率。RB+E組幼苗的ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC均低于RB組。這些結果表明單位反應中心吸收的光能、捕獲光能的能力增加，可能是由于一些RCs失活，并認為熱耗散是由于非活動RCs的高耗散而增加[26]。

葉綠素熒光參數(shù)的變化可以作為探究植物的光合過程及一些環(huán)境因素對其影響的重要手段[27]。性能指數(shù)是JIP-test的參數(shù)中最敏感的參數(shù)之一[28]。稻瘟病菌感染的水稻幼苗，其性能指數(shù)、量子產(chǎn)額和最大光化學效率顯著下降，比活性參數(shù)顯著增加，說明稻瘟病菌已經(jīng)影響PSⅡ的正常功能，而內(nèi)生菌處理的水稻幼苗則能夠維持PSⅡ穩(wěn)定性，保持高效的PSⅡ功能。

4 結 論

內(nèi)生菌侵染可以使水稻幼苗防御酶活性增強，降低MDA含量，使葉片放氧復合體穩(wěn)定，電子傳遞正常進行，保持高效的PSⅡ功能，從而提高水稻對稻瘟病的抗性。