固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻的生長與生理及其對(duì)廢水無機(jī)氮的去除效果

李 旸，王祎哲，孫小雨，賈旭穎，周文禮，高金偉，邵 蓬，竇 勇

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津 300384)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 微藻 纖細(xì)裸藻(Euglenagracilis)由天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為去離子水配制的經(jīng)121.3 ℃條件下滅菌20 min的AF-6培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為55 μmol/(m2·s)，光暗比12 L∶12 D。每天至少3次定時(shí)搖動(dòng)藻液，防止其貼壁或沉淀。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒來源于北京索萊寶科技有限公司，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固定化藻球的制備 微藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(細(xì)胞密度為1.8×106cell/mL)，離心濃縮，棄去上清液，取一定體積的微藻細(xì)胞濃縮液混合于4%海藻酸鈉溶液中，用10 mL注射器在距離預(yù)冷的2% CaCl2溶液水面20 cm處以60滴/min左右的速度滴入，形成小球狀。滴入的藻液進(jìn)入CaCl2溶液后形成藻珠后，靜置1 h，滅菌去離子水洗滌多次后備用，培養(yǎng)12 d，培養(yǎng)條件同1.1.1。

1.2.2 小球藻膠球解固定 從培養(yǎng)液中取出一定數(shù)量的藻珠，滴加一定量的3%的檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)溶液，靜置至藻珠完全溶解。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 細(xì)胞密度測(cè)定 每2 d取樣，采用血球計(jì)數(shù)板法[20]對(duì)藻細(xì)胞密度進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)公式(μ=(lnN-lnN0)/(t-t0) 計(jì)算相對(duì)生長速率，其中，μ為相對(duì)生長速率,N、N0分別為t時(shí)刻的藻密度、t0(初始)時(shí)刻藻密度。

1.3.2 色素含量測(cè)定 每2 d取樣，用乙醇法[21]對(duì)藻類進(jìn)行測(cè)定的方式測(cè)定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量。樣品離心棄上清，加入95%乙醇溶液于4 ℃冷藏24 h，經(jīng)離心后取上清，測(cè)定各波長下吸光值。

Ca(mg/L)=13.95A665- 6.88A649

(1)

Cb(mg/L)=24.96A649- 7.32A665

(2)

Cc(mg/L)=(1000A470- 2.05Ca-114.8Cb)/245

(3)

式中：Ca、Cb、Cc分別為葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的濃度。A665、A649和A470分別為色素提取液在波長665、649和470 nm下的吸光度。

1.3.3 抗氧化指標(biāo)測(cè)定 在第0、6、12天取樣離心，收集藻細(xì)胞。按照對(duì)應(yīng)的試劑盒使用說明進(jìn)行超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA測(cè)定。SOD酶活性單位定義為在黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為1個(gè)酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019分析處理，利用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖，采用SPSS 17.0進(jìn)行T檢驗(yàn)(T-test)，顯著性水平設(shè)為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻生長的影響

如圖1-a所示，兩處理組的細(xì)胞密度均呈上升趨勢(shì)，并且固定化組的細(xì)胞密度始終高于對(duì)照組。試驗(yàn)前2 d，固定化組的細(xì)胞密度略大于液體懸浮化，但未產(chǎn)生顯著差異(P>0.05)。至第4 天，兩處理組產(chǎn)生顯著差異(P<0.05)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12 d)，固定化纖細(xì)裸藻細(xì)胞密度達(dá)到最大，為5.6×106cell/mL，為對(duì)照組細(xì)胞密度的1.42倍。如圖1-b所示，固定化纖細(xì)裸藻細(xì)胞密度的相對(duì)增長率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，為對(duì)照組的1.52倍。

2.2 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻光合色素的影響

如圖2-a所示，前4 d，液體懸浮態(tài)葉綠素a含量高于固定化組，但差異不顯著(P>0.05)。第6天起，固定化組葉綠素a含量均高于對(duì)照組，且在第6、8、12天差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12 d)，固定化組的葉綠素a含量為對(duì)照組的1.19倍。如圖2-b所示，前4 d，液體懸浮態(tài)葉綠素b含量高于固定化組，但差異不顯著(P>0.05)。第6天起，固定化組葉綠素b含量均高于對(duì)照組，且在第6、12天差異顯著(P<0.05)。兩處理組的葉綠素b含量均在第10天達(dá)到最大值，而后出現(xiàn)下降。第12天，固定化組的葉綠素b含量為對(duì)照組的1.18倍。如圖2-c所示，前4 d，兩處理組的類胡蘿卜素差異不顯著(P>0.05)。第6 天起，固定化組類胡蘿卜素含量均高于對(duì)照組，且差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12 d)，固定化組類胡蘿卜素含量為對(duì)照組的1.66倍。如圖2-d所示，前4 d，液體懸浮態(tài)總光合色素含量高于固定化組，但差異不顯著(P>0.05)。第6天起，固定化組總光合色素含量均高于對(duì)照組，且在第6、8、12天差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)期間，固定化組的總光合色素含量持續(xù)升高，在12 d達(dá)到峰值，為對(duì)照組的1.3倍。

2.3 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖3-a所示，試驗(yàn)期間，固定化組的SOD呈先降低后升高的趨勢(shì)，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12 d)出現(xiàn)最大值。而對(duì)照組SOD逐漸降低，在試驗(yàn)開始時(shí)(0 d)出現(xiàn)最大值。前6 d，兩處理組的SOD差異不顯著(P>0.05)。第12天，固定化組SOD大幅升高，兩處理組SOD差異顯著(P<0.05)，固定化組為對(duì)照組的1.34倍。如圖3-b所示，兩處理組的MDA均呈先降低后升高的趨勢(shì)，且最大值均在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12 d)出現(xiàn)。前6 d，兩處理組的MDA差異不顯著(P>0.05)。第12天，液體懸浮態(tài)處理組MDA大幅升高，兩處理組MDA差異顯著(P<0.05)，對(duì)照組為固定化組的1.18倍。

2.4 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻無機(jī)氮去除效果的影響

3 討 論

3.1 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻生長的影響

藻細(xì)胞密度客觀地反映了微藻的生長狀況[23]，固定化培養(yǎng)在一定程度上改變了藻細(xì)胞的生存環(huán)境和其自身的適應(yīng)性。在本研究中，固定化纖細(xì)裸藻出現(xiàn)了2 d的生長延遲期，從第4天起細(xì)胞密度大幅增長，最終高于對(duì)照組。毛欣欣等[24]以海藻酸鈉(SA)固定培養(yǎng)原綠球藻(Prochlorococcus)，固定化處理組出現(xiàn)生長延遲的現(xiàn)象，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。汪洋等[25]以海藻酸鈣(CAS)制備固定化小球藻，發(fā)現(xiàn)懸浮態(tài)小球藻雖然生長速率較快，但生長周期短，在經(jīng)歷對(duì)數(shù)期后生長迅速衰退；而固定化組雖然生長速率比較緩慢，但生長周期長，而且可重復(fù)利用，有利于構(gòu)建固定化生物催化和生物轉(zhuǎn)化體系。由此可知，固定化技術(shù)有利于藻細(xì)胞生長，但在初期會(huì)出現(xiàn)生長延遲，這是由于固定化限制了藻細(xì)胞的生長空間，細(xì)胞聚集出現(xiàn)自遮蔽現(xiàn)象使光穿透率下降[26]。相比之下，液體懸浮態(tài)初期的光合作用較強(qiáng)，生長速度較快，但易進(jìn)入穩(wěn)定期與衰亡期，減緩生長速度，這可能與空間競(jìng)爭和營養(yǎng)物質(zhì)快速耗盡有關(guān)。除此之外，固定基質(zhì)和藻酸鹽基質(zhì)之間的離子相互作用所引起的物理壓力會(huì)改變細(xì)胞周圍的微環(huán)境，也可能會(huì)使生長出現(xiàn)延遲[27]。

3.2 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻色素含量的影響

光合色素是藻類捕光和傳遞光量子的重要成分[28],其變化可直接反映光合作用的效率，而光合作用與藻類的生長狀態(tài)密切相關(guān)。纖細(xì)裸藻的光合色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素[29]。葉綠素a在藻細(xì)胞捕光系統(tǒng)中起主要作用[30]，葉綠素b可以有效地捕捉并利用藍(lán)紫光進(jìn)行光合作用[31]，類胡蘿卜素不僅具有捕光功能，還參與光保護(hù)并對(duì)環(huán)境刺激發(fā)生響應(yīng)[32]?？偣夂仙伢w現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)行最優(yōu)光合作用的所有色素的動(dòng)態(tài)平衡[33]。

試驗(yàn)初期(前4 d)，固定化組的葉綠素a與總光合色素含量均略低于懸浮態(tài)藻組，葉綠素b和類胡蘿卜素差異不顯著。從第6天起，固定化組的光合色素增含量迅速升高，與對(duì)照組差異顯著，對(duì)照組光合色素增加緩慢甚至降低。固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻中后期的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、總光和色素含量都有很大程度的增加，說明固定化細(xì)胞初期處于環(huán)境脅迫中且色素合成被抑制。Matthew 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，固定化培養(yǎng)對(duì)藻類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝有影響。推測(cè)是由于固定化纖細(xì)裸藻空間受限，前期生長較緩慢，并且對(duì)物質(zhì)能量消耗也有所降低所導(dǎo)致。而后期隨細(xì)胞密度增大，光合作用也會(huì)大幅增加。高鵬等[34]發(fā)現(xiàn)固定化銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)可提高微藻的合成代謝，這可能是固定化微藻光合作用優(yōu)于液體懸浮態(tài)微藻的原因之一。試驗(yàn)后期對(duì)照組缺乏對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的合成代謝會(huì)降低光合速率，修復(fù)率和光化學(xué)效率，從而影響光合系統(tǒng)[35]。因此，固定化培養(yǎng)提高了纖細(xì)裸藻的合成代謝，從而使纖細(xì)裸藻的色素含量增加且色素下降時(shí)間得到了延緩。

3.3 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻抗氧化指標(biāo)的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化酶防御系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶[36]，在機(jī)體抗氧化和抗氧化能力的平衡中起著至關(guān)重要的作用[37]。本試驗(yàn)中，固定化處理組呈先降低再升高的趨勢(shì)，而懸浮態(tài)處理組出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。前6 d，兩處理組差異顯著(P>0.05)，至第12天，固定化處理組增加迅速，兩組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。由此推測(cè)，固定化纖細(xì)裸藻初期受到環(huán)境脅迫，生長速度較慢，藻細(xì)胞需要一段緩沖期，以合成抗氧化酶。細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激可在許多種類的光合作用微藻中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗氧化劑，從而增加了酶促抗氧化劑(例如超氧化物歧化酶)和非酶促抗氧化劑(例如胡蘿卜素)的含量增加[38]。當(dāng)固定化纖細(xì)裸藻進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期，酶活力加強(qiáng)，而液體懸浮態(tài)纖細(xì)裸藻已進(jìn)入穩(wěn)定期或衰退期。因此，固定化培養(yǎng)可延長微藻的生長周期。有研究發(fā)現(xiàn)，以35‰的鹽水脅迫游離態(tài)和4種以不同條件固定化的小球藻后，4種固定化小球藻的SOD活性均以不同程度高于BG11培養(yǎng)液中的小球藻[39]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。說明固定化培養(yǎng)微藻可以有效提高藻細(xì)胞的SOD活性，使其抗逆能力增強(qiáng)。

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物[40]，它能反映機(jī)體的脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度，并間接反映組織過氧化損傷的程度[41]。本研究中，兩處理組的MDA含量均呈先降低在升高的趨勢(shì)。試驗(yàn)前期兩個(gè)處理組差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(12 d)，液體懸浮態(tài)組MDA顯著高于固定化組(P<0.05)。這可能是由于本試驗(yàn)中所用的固定化載體海藻酸鈉(SA)會(huì)對(duì)纖細(xì)裸藻造成輕微脅迫，細(xì)胞會(huì)受到輕微損害。固定化組在試驗(yàn)初期MDA含量較高，隨后，藻細(xì)胞逐漸適應(yīng)固定化環(huán)境并開始迅速增長， MDA含量有所下降，反映出抗氧化保護(hù)增強(qiáng)。而試驗(yàn)后期固定化處理組細(xì)胞密度過高，其生長環(huán)境有所惡化，導(dǎo)致MDA含量升高。但與對(duì)照組相比不難發(fā)現(xiàn)，固定化培養(yǎng)纖細(xì)裸藻可以有效降低細(xì)胞損傷。有研究表明，以水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水脅迫游離態(tài)和4種以不同條件固定化的小球藻后，4種固定化小球藻MDA含量均以不同程度低于BG11培養(yǎng)液中的小球藻[39]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.4 固定化培養(yǎng)對(duì)纖細(xì)裸藻無機(jī)氮去除效果的的影響

4 結(jié) 論