產(chǎn)黃酮馬齒莧內(nèi)生真菌的篩選及代謝產(chǎn)物抑菌效果初步研究

艾加敏,余天飛,李 靜,姜影影,柳曉東,鄧振山

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 延安 716000)

0 引 言

植物內(nèi)生菌(Endophyte)是指能夠生活在植物各組織和器官內(nèi)，而不引起植物病變的一類微生物，可分為真菌、細(xì)菌和放線菌三大類[1]，自1993年A.Stierle等[2]人從紅豆杉中分離得到一株能夠產(chǎn)紫杉醇的Taxomycesandreanae的真菌后，為植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)天然活性物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。植物的生長各階段、藥用成分都與內(nèi)生菌尤其是內(nèi)生真菌[3]相關(guān)，植物內(nèi)生真菌的主要代謝產(chǎn)物為糖類、苯丙素類、醌類、黃酮類、萜類、甾體和生物堿等類群[4]，其中黃酮類化合物因具有抗炎、抗菌和抗病毒等作用而受到普遍關(guān)注[5-6]。馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)為常見草本植物，主要生物活性成分：黃酮類、生物堿、多糖類、兒茶酚、三萜類，具有抗菌、抗氧化作用、抗病毒等作用[7-10]，目前主要集中在對馬齒莧代謝產(chǎn)物的研究，但對產(chǎn)黃酮馬齒莧內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究仍比較少。

本研究從馬齒莧中分離出內(nèi)生真菌，以黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜特征對內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物初步鑒定，篩選出產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，擴增其18S rDNA序列，并結(jié)合菌落和分生孢子的形態(tài)特征，對菌株進行鑒定，并采用濾紙片法，測試其代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，探究其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最小抑菌濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用野生馬齒莧采自于陜西省延安市棗園鎮(zhèn)(N36°37′22.11″，E109°25′44.09″)，用無菌采樣袋避光運回實驗室，材料需當(dāng)天開展試驗使用。

1.1.1 指示菌株

試驗所用金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)由延安大學(xué)資源與環(huán)境微生物實驗室提供。

1.1.2 主要儀器

GR110DA滅菌器(廈門致微儀器有限公司)，UV-1780紫外可見光分光光度計(日本島津)，T960型PCR儀(力康生物科技有限公司)，RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海昕儀儀器儀表有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時，則需另加入15.0～20.0 g瓊脂粉。

PYG培養(yǎng)基(peptone yeast glucose broth)：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏0.2 g，葡萄糖5.0 g，NaCl：0.5 g，MgSO4·7H2O：1.5 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時，則需另加入15.0～20.0 g瓊脂粉。

水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉17.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 樣品的表面消毒

將采集馬齒莧的根和莖用無菌水進行多次沖洗，去除表面塵土，待表面干燥，進行表面消毒處理，莖使用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液消毒40 s，然后再使用體積分?jǐn)?shù)為3%次氯酸鈉溶液消毒4 min，根使用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液消毒30 s、然后再使用體積分?jǐn)?shù)為3%次氯酸鈉溶液消毒2 min。樣品表面消毒完全后，備用。

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1.2.2 內(nèi)生真菌的分離、純化

用無菌水沖洗消毒完全的莖和根3次，最后一次沖洗植物組織的無菌水用移液槍吸取30.0 μL移入PYG、PDA平板中，用涂布器涂抹均勻，以此作為對照組。將消毒完全的莖和根與滅菌石英砂一起研磨，加入10.0 mL的無菌水制成懸液，依次進行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為：10、102、103、104、105、106，將稀釋好的懸液30.0 μL分別涂布在PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃，培養(yǎng)5 d，每個梯度設(shè)置3個平行對照，以氣生菌絲和營養(yǎng)菌絲的形態(tài)、長度和顏色為分類依據(jù)，挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA固體培養(yǎng)基上，進行菌種純化，菌株編號依次為：AG-1、AG-2、AG-3、……AG-n。

1.2.3 內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物提取

將所分離純化的馬齒莧內(nèi)生真菌接種至PDA液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵，28 ℃，160 r/min，發(fā)酵7 d，發(fā)酵液體積為2.0 L，待發(fā)酵完畢，四層紗布過濾發(fā)酵液，除去菌絲，將濾液100 ℃水浴加熱，濃縮至50.0 mL，濃縮液先用50.0 mL石油醚除去脂質(zhì)等雜質(zhì)，然后再用乙酸乙酯分3次萃取濃縮液中馬齒莧內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物，濃縮液與萃取劑的體積比始終保持1∶1，合并3次萃取劑，65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯，蒸發(fā)至近干后用20.0 mL甲醇溶解固體物質(zhì)，過0.45 μm有機系濾膜，揮干甲醇備用[11]。

1.2.4 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌篩選

參考《天然藥物化學(xué)(第6版)》中黃酮類化合物顯色反應(yīng)[12]，對所提取的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進行顯色反應(yīng)，所選擇的黃酮類化合物顯色反應(yīng)為：硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)、鹽酸鋅粉反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、氫氧化鈉反應(yīng)、乙酸鎂反應(yīng)。并對符合黃酮類化合物顯色反應(yīng)的菌株代謝產(chǎn)物進行紫外光譜掃描[13]，紫外光譜用甲醇作為參比溶液，建立基線，檢測波長為200 nm～800 nm，掃描速度為高速，狹縫寬設(shè)置為2.0，獲得光譜。符合黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜圖特征的菌株代謝產(chǎn)物，可認(rèn)為該菌株能夠產(chǎn)黃酮，上述反應(yīng)中以蘆丁為陽性對照，以無菌水為陰性對照。

1.2.5 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌鑒定

使用ITS1、ITS4引物，擴增菌株18S rDNA序列進行分子生物學(xué)鑒定，總DNA提取使用索萊寶公司生產(chǎn)的真菌基因組DNA提取試劑盒(Fungi Genomic DNA Extraction Kit)，擴增18S rDNA序列所使用的引物為ITS1(5′-CTTCGTCATTAGAGAAGTAA-3′)，ITS4(5-TCCTCCGCTTAGATATGC-3)，PCR(polymerase chain reaction)反應(yīng)體系和條件參照康為世紀(jì)生產(chǎn)2×Taq MasterMix(Dye)所提供的反應(yīng)體系和條件，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s；72 ℃延伸 50 s，35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃低溫保存。

PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，90 V水平電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢查擴增結(jié)果。擴增產(chǎn)物送至上海生工進行測序，測序結(jié)果在NCBI(national center for biotechnology information)數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，使用軟件MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并將測序結(jié)果上傳至GenBank，申請菌株序列登錄號。

1.2.6 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測定

采用濾紙片法對產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測試，待測內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物1.0 g，溶于100.0 mL水中，此時質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL，并稀釋成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL的溶液備用。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌用無菌水配制成OD600=1.00的指示菌菌懸液，30 μL涂布在PYG(peptone yeast glucose broth)固體培養(yǎng)基上，將浸潤在各個濃度代謝產(chǎn)物溶液中的濾紙片放在涂布過指示菌的PYG固體培養(yǎng)基上，28 ℃，培養(yǎng)4 d，測量抑菌圈直徑。每組實驗設(shè)置3個平行對照，以無菌水為空白對照，指示菌為金黃色葡萄球菌，為革蘭氏陽性菌，故陽性藥物1選用青霉素；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，故陽性藥物2選用頭孢唑林鈉。選用等濃度的青霉素和頭孢唑林鈉作為陽性對照。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌篩選

2.1.1 內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物顯色反應(yīng)

使用PDA固體培養(yǎng)基從馬齒莧根和莖中分離得到5株代謝產(chǎn)物與黃酮顯色反應(yīng)相似的菌株，如表1所示。其中菌株AG-10和AG-7硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)為陽性，菌株AG-10在所進行的顯色試驗中均呈陽性，初步鑒定菌株AG-10代謝產(chǎn)物為黃酮類化合物。

表1 顯色反應(yīng)結(jié)果Table 1 Results of color reaction

2.1.2 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物紫外光譜檢測

黃酮類化合物的甲醇溶液普遍在200 nm～400 nm會出現(xiàn)兩個峰帶，即300 nm～400 nm峰帶Ⅰ和220 nm～280 nm峰帶Ⅱ[12]，以黃酮類代表物質(zhì)蘆丁紫外光譜圖為對照，對菌株AG-10代謝產(chǎn)物進行紫外光譜分析，結(jié)果如圖1所示，菌株AG-10在376.0 nm處有弱吸收峰，在269.0 nm、219.0 nm、207.0 nm處有3個明顯的吸收峰，蘆丁在357.6 nm、256.6 nm、206.0 nm處有3個明顯吸收峰，蘆丁和菌株AG-10代謝產(chǎn)物均在300 nm～400 nm和220 nm～280 nm出現(xiàn)吸收峰，這與黃酮類化合物吸收峰特征相符，結(jié)合顯色試驗反應(yīng)結(jié)果，進一步說明菌株AG-10代謝產(chǎn)物中含有黃酮類物質(zhì)。

圖1 AG-10代謝產(chǎn)物紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of AG-10 metabolites

2.2 菌株鑒定

AG-10菌絲前期呈白色，后期呈淺黃色，菌絲稀疏平鋪較長，菌落背面為淺黃棕色，菌落中間厚邊緣略薄，分生孢子梗細(xì)長，分支，孢子鐮刀形，無色；18S rDNA序列PCR擴增產(chǎn)物大小為550 bp，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結(jié)果顯示AG-10與Fusariumoxysporum(JX045827) 18S rDNA序列相似性為99%，選擇18S rDNA序列相似性大于99%的菌株序列，使用MEGA-X軟件，采用N-j法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)合菌株的形態(tài)特征和18S rDNA序列，初步鑒定AG-10為鐮孢霉(Fusariumsp.)，測序結(jié)果上傳至GenBank申請序列登錄號：MK951708。

圖2 菌株AG-10鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of AG-10 strain

2.3 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測定

參考抑菌圈實驗標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>20 mm屬于極敏感，15～20 mm屬于高敏感，10～15 mm屬于中敏感，7～9 mm屬于低敏感，抑菌圈直徑<7 mm屬于不敏感[16]。

AG-10內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物抑菌活性結(jié)果如表2、表3所示，代謝產(chǎn)物抑菌效果隨著代謝產(chǎn)物濃度的增加而增加。代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌有抑制作用，但效果不明顯，對大腸桿菌無抑菌作用；代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌圈直徑在4～6 mm范圍內(nèi)，屬于不敏感，對大腸桿菌有抑菌作用，但效果不明顯；代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，抑菌圈直徑在10～13 mm范圍內(nèi)，屬于中敏感，對大腸桿菌有抑菌作用，抑菌圈直徑在7～9 mm范圍內(nèi)，屬于低敏感；代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌有十分明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑在17～19 mm范圍內(nèi)，屬于高敏感，對大腸桿菌有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑在12～14 mm范圍內(nèi)，屬于中敏感。AG-10代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，對大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL。

表2 不同濃度AG-10代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌抑制效果Table 2 Inhibition effect of AG-10 metabolites with different concentrations on Staphylococcus aureus

表3 不同濃度AG-10代謝產(chǎn)物對大腸桿菌抑制效果Table 3 Inhibition effect of AG-10 metabolites at different concentrations on Escherichia coli

3 討 論

據(jù)現(xiàn)有報道，趙慶云等[17]利用HLPC-UV技術(shù)從銀杏中分離、篩選出7株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌，結(jié)合內(nèi)生真菌菌絲形態(tài)和孢子特征，鑒定為匐柄霉、叢梗孢屬、交鏈孢屬、鐮孢霉屬、赤霉屬、蜜孢霉、和暗梗單孢霉屬。張海龍等[18]通過顯色反應(yīng)、薄層層析(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(high-performance liquid chromatograhy，HPLC)從銀杏中分離得到兩株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌，卷枝毛霉和尖鐮孢霉。騰艾靜等[13]對苣荬菜中黃酮類化合物的抑菌活性進行了研究，結(jié)果顯示，苣荬菜中黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

本研究從馬齒莧根內(nèi)篩選出一株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌AG-10，通過形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合18S rDNA序列，鑒定為鐮孢霉菌。AG-10代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/mL和2.0 mg/mL，且抑菌活性與濃度存在一定的量效關(guān)系，隨濃度增加，抑菌活性也呈正比例關(guān)系逐漸增加。AG-10代謝產(chǎn)物的抑菌活性與等濃度的青霉素與頭孢唑林鈉相比效果較弱，可能是由于未對AG-10代謝產(chǎn)物進行純化，代謝產(chǎn)物成分較為復(fù)雜。下一步可對AG-10代謝產(chǎn)物進行分離、純化，以期獲得高純度的抑菌活性物質(zhì)。

馬齒莧中黃酮的藥理學(xué)研究已逐漸成為一個研究的熱點，有研究表明，馬齒莧中的黃酮類化合物具有抗菌消炎、降脂等多種作用，本研究中AG-10黃酮類代謝產(chǎn)物與馬齒莧植源型黃酮類化合物是否具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，還有待研究。下一步應(yīng)對AG-10菌株進行生理特性研究和菌體內(nèi)黃酮代謝途徑的研究。在初步分離的內(nèi)生真菌中，AG-4、AG-5、AG-7和AG-9四株菌代謝產(chǎn)物黃酮類顯色反應(yīng)中有一種或幾種微弱的陽性反應(yīng)，有可能是發(fā)酵液中黃酮含量較低，代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，從而影響顯色反應(yīng)結(jié)果，因此下一步研究應(yīng)采取高效液相(HPLC)、質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)等方法[19]，對代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進一步分析，將產(chǎn)黃酮類真菌的代謝產(chǎn)物一一分離，得到單體化合物。并通過發(fā)酵條件和工藝優(yōu)化等方法和手段，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，使利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)成為可能。

4 結(jié) 論

本研究從馬齒莧中分離內(nèi)生真菌，以黃酮類化合物顯色反應(yīng)和紫外光譜特征對內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進行初步鑒定，篩選出產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌AG-10，經(jīng)鑒定AG-10鐮孢霉，其代謝產(chǎn)物可抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/mL和2.0 mg/mL。