miR-152基因多態(tài)性與子癇前期易感性的相關(guān)性分析

陳志琴，陳文玲，潘凌云，王慧君

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院婦兒科，江西 南昌 330000；2.江西省婦幼保健院產(chǎn)科，江西 南昌 330000)

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種在妊娠期間發(fā)生的疾病，子癇前期的患病率在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家分別為2%～5%和10%[1]。在我國(guó)，子癇前期的患病率為8%左右，子癇前期被認(rèn)為是引起產(chǎn)婦和新生兒死亡的主要原因之一[2]。子癇前期開(kāi)始于滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，并以內(nèi)皮細(xì)胞功能的衰竭而告終。研究表明，慢性腎功能衰竭、高齡、感染、動(dòng)脈硬化、胎盤屏障損傷、母體的血液循環(huán)中存在滋養(yǎng)細(xì)胞及慢性高血壓是發(fā)生子癇前期的危險(xiǎn)因素[3]。子癇前期的病因包括炎癥免疫反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和異常胎盤浸潤(rùn)等。MicroRNA(miRNA)是包含了19～25個(gè)核苷酸的單鏈RNA的小型非編碼RNA分子，能夠在廣泛的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用[4]。miRNA與靶基因的3′-UTR區(qū)域結(jié)合以調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能會(huì)改變miRNA的特性，從而影響其成熟度或改變其與靶標(biāo)結(jié)合的能力。miRNA-152在細(xì)胞增殖、集落形成和血管生成中起作用[5]。miRNA通過(guò)靶向低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來(lái)影響血管生成和對(duì)缺氧的反應(yīng)能力[6]。HIF-1α作為miRNA-152的靶基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)性，其與多種缺氧響應(yīng)靶基因(如VEGF)結(jié)合。miRNA表達(dá)失調(diào)的原因之一是其基因的變異或SNP。這種多態(tài)性與該miRNA的3′-UTR區(qū)C到T的變化相關(guān)，從而影響基因的甲基化[7]。miRNA對(duì)子癇前期發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響已有相關(guān)研究，既往研究顯示miR-142、miR-126中的突變與子癇前期的發(fā)生有關(guān)[8]。本研究旨在探討miR-152 rs526487多態(tài)性與孕婦發(fā)生子癇前期的關(guān)系，為子癇前期的早期診斷及治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料

本研究納入聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院2017年1月至2019年10月收治的156例診斷為子癇前期的孕婦，作為病例組；134例門診孕檢血壓正常的孕婦作為對(duì)照組。在156例子癇前期患者中，62例為輕度子癇前期，94例為重度子癇前期；100例為早發(fā)型子癇前期(妊娠34周前確診)，56例為晚發(fā)型子癇前期(妊娠34周后確診)。本研究的所有孕婦均已簽署知情同意書(shū)。子癇前期的定義：妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≥140mmHg和(或)舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)≥90mmHg。24h尿液中的蛋白質(zhì)≥300mg或隨機(jī)尿蛋白/肌酐≥0.3，或隨機(jī)尿蛋白(+)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有葡萄胎、肝功能異常、慢性高血壓、潛在的腎臟疾病、多胎妊娠、子宮肌瘤、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡者。

1.2 miR-152基因的rs526487 SNP檢測(cè)

靜脈血樣品收集在含EDTA的試管中，保持在-80℃直至DNA提取。使用鹽析法提取基因組DNA。使用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)，鑒定了miR-152 SNP rs526487的基因型，其正向和反向引物及其擴(kuò)增子特性如下：5′-TGTGCGTACTGGCACTGACTGTCGTA-3′，5′-TGAC

GTGGTACTTGCGGTGACTGTCTA-3′。PCR-RFLP預(yù)混液的制備如下：最終體積為15μL，0.8μL的10μM正向和反向引物溶液，1.5μL緩沖液(10×)，0.5μL dNTP 10μM，1μL Taq DNA聚合酶，1μL DNA(100ng/μL)和0.75μL 50mM MgCl2。PCR反應(yīng)程序設(shè)置如下：在95℃下變性5min，然后在95℃下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)25s，在61℃下進(jìn)行20s，到72℃退火25s，最后延伸72℃ 5min。通過(guò)加入1μL緩沖液，0.3μL DdeI(Thermo，USA)消化PCR產(chǎn)物(8.9μL)，然后在37℃下孵育16h，在-20℃下保存。通過(guò)在80V下使用4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳獲得消化的產(chǎn)物。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、分析。多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與易感性的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)分析，多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與易感性的風(fēng)險(xiǎn)分析采用二元Logistic回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1兩組一般情況比較

病例組年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、身高、體重、三酯甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；病例組舒張壓、收縮壓高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.745、13.885，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般情況比較Table 1 Comparison of general information between the two

2.2兩組miR-152 rs526487各基因型突變型比較

病例組miR-152 rs526487 AA基因型比例高于對(duì)照組，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于對(duì)照組，兩組各基因型所占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=58.965，P<0.05)，見(jiàn)表2。miR-152 rs526487 AA基因型能增加子癇前期易感性(OR=11.429，95%CI=5.91～22.78，P<0.05)。

表2 兩組miR-152 rs526487各基因型突變型比較[n(%)]Table 2 Comparison of miR-152 rs526487 genotype mutations between the two groups[n(%)]

2.3兩組miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較

病例組miR-152 rs526487 A等位基因的比例高于對(duì)照組，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=104.957，P<0.05)，見(jiàn)表3。miR-152 rs526487 A等位基因頻率能增加子癇前期易感性(OR=2.947，95%CI=2.282～3.898，P<0.05)。

表3 兩組miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較[n(%)]Table 3 Comparison of the mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between the two groups[n(%)]

2.4輕度、重度子癇前期患者的miR-152 rs526487各基因型突變型比較

重度子癇前期患者的miR-152 rs526487 AA基因型比例高于輕度子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于輕度子癇前期，輕度子癇前期與重度子癇前期患者各基因型比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=48.654，P<0.05)，見(jiàn)表4。miR-152 rs526487 AA基因型與子癇前期的嚴(yán)重程度有關(guān)系(OR=13.685，95%CI=4.251～25.698，P<0.05)。

表4 輕度、重度子癇前期患者miR-152 rs526487各基因型突變型比較[n(%)]Table 4 Comparison of miR-152 rs526487 genotype mutations between mild preeclampsia and severe preeclampsia[n(%)]

2.5輕度、重度子癇前期患者的miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較

重度子癇前期患者的miR-152 rs526487 A等位基因比例高于輕度子癇前期，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于輕度子癇前期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=123.365，P<0.05)，見(jiàn)表5。miR-152 rs526487 A等位基因頻率與子癇前期的嚴(yán)重程度有關(guān)系(OR=2.741，95%CI=1.895～3.941，P<0.05)。

表5 輕度、重度子癇前期患者的miR-152 rs526487各等位基因突變頻率比較[n(%)]Table 5 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between mild preeclampsia and severe preeclampsia[n(%)]

2.6早發(fā)型、晚發(fā)型子癇前期患者的rs526487各基因型突變型比較

早發(fā)型子癇前期患者的miR-152 rs526487 AA基因型比例高于晚發(fā)型子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于晚發(fā)型子癇前期，早發(fā)型子癇前期與晚發(fā)型子癇前期患者各基因型比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=47.547，P<0.05)；miR-152 rs526487 AA基因型與子癇前期發(fā)病時(shí)間有關(guān)系(OR=10.478，95%CI=5.20～23.698，P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 早發(fā)型、晚發(fā)型子癇前期的miR-152 rs526487各基因型突變型比較[n(%)]Table 6 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between late-onset preeclampsia and early-onset preeclampsia[n(%)]

2.7 早發(fā)型、晚發(fā)型子癇前期患者的miR-152 rs526487等位基因突變頻率比較

早發(fā)型子癇前期患者的miR-152 rs526487 A等位基因比例高于對(duì)照組，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于對(duì)照組，其等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=129.365，P<0.05)，見(jiàn)表7。miR-152 rs526487 A等位基因頻率與子癇前期的發(fā)病時(shí)間有關(guān)系(OR=2.845，95%CI=2.012～3.998，P<0.05)。

表7 早發(fā)型、晚發(fā)型子癇前期的miR-152 rs526487等位基因突變頻率比較[n(%)]Table 7 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between late-onset preeclampsia and early-onset preeclampsia[n(%)]

3討論

3.1 miRNA與子癇前期的關(guān)系

子癇前期是妊娠期常見(jiàn)的并發(fā)癥，其特征是患者在妊娠20周后新發(fā)高血壓和蛋白尿。此外，子癇前期患者可能出現(xiàn)腎功能不全、肝臟疾病。miRNA作為妊娠期疾病的新生物標(biāo)志物，其表達(dá)缺失與妊娠期疾病相關(guān)[9]。報(bào)道顯示，子癇前期患者miR-126表達(dá)減少、miR-15b表達(dá)增加，miR-126、miR-15b分別具有促血管生成和血管抑制作用[10]，miR-152具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成的作用[11]。miR-152被認(rèn)為是子癇前期的新型潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

3.2 子癇前期患者的miR-152 rs526487多態(tài)性

近期研究表明miR-152是T輔助淋巴細(xì)胞的主要細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。miR-152在懷孕期間增加[12]。miR-152基因位于5q31.1號(hào)染色體上的細(xì)胞因子基因簇內(nèi)，其第三內(nèi)含子有70bp的可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性。miR-152 rs526487多態(tài)性包含3個(gè)等位基因：AA、AG、GG；GG等位基因的頻率高于AA等位基因，AG等位基因很稀少，這在少數(shù)人群中已被證實(shí)[13]。

3.3 miR-152 rs526487多態(tài)性與子癇前期易感性的關(guān)系

miR-152 rs526487基因多態(tài)性位于miR-152基因的內(nèi)含子，其可改變信使核糖核酸的剪接，導(dǎo)致不同的剪接變體。研究表明miR-152 rs526487 AA/GG基因型與miR-152的高表達(dá)有關(guān)，AA等位基因與miR-152的高表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)性[14]。這一發(fā)現(xiàn)支持了本研究在子癇前期患者中發(fā)現(xiàn)血清miR-152水平升高的結(jié)果。miR-152 rs526487多態(tài)性與多種疾病有關(guān)，如平滑肌瘤、子宮頸癌、乳腺癌、終末期腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、口腔癌和川崎病[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組miR-152 rs526487 AA基因型比例、A等位基因頻率高于對(duì)照組，miR-152 rs526487 GG基因型比例、G等位基因頻率低于對(duì)照組，miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因頻率能增加子癇前期易感性，與其他研究結(jié)果[14]一致。

3.4 miR-152 rs526487多態(tài)性與子癇前期嚴(yán)重程度、發(fā)病時(shí)間的關(guān)系

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期miR-152 rs526487 AA基因型比例、A等位基因頻率高于輕度子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例、G等位基因頻率低于輕度子癇前期；miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因頻率與子癇前期患者病情有關(guān)，早發(fā)型子癇前期miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因頻率高于晚發(fā)型子癇前期，miR-152 rs526487 GG基因型、G等位基因頻率低于晚發(fā)型子癇前期；miR-152 rs526487 AA基因型、G等位基因頻率與子癇前期發(fā)病時(shí)間有關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)子癇前期的主要誘因是缺氧，從而導(dǎo)致胎盤功能不全。HIF-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，其在胎盤中的表達(dá)隨著缺氧程度的增加而增加。目前尚無(wú)研究調(diào)查子癇前期患者中HIF-1α和miR-152表達(dá)之間的關(guān)系[16]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在HIF-1α的靶向調(diào)節(jié)下，宮頸癌細(xì)胞中的缺氧反應(yīng)誘導(dǎo)了miR-152表達(dá)，這對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。此外，miR-152 rs526487 AA的等位基因頻率與HIF-1α以及乳腺癌、哮喘的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[17-19]。因此推測(cè)miR-152 rs526487 AA的等位基因頻率升高導(dǎo)致的子癇前期嚴(yán)重程度及發(fā)病速度增加可能與HIF-1α有關(guān)，這有待于在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究。

3.5本研究不足之處及展望

本研究為單中心病例對(duì)照研究，樣本量少，在后續(xù)研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入探討子癇前期的病因，為該病的治療提供依據(jù)。

綜上所述，miR-152 rs526487 AA基因型和A等位基因均與子癇前期的易感性、嚴(yán)重程度、發(fā)病速度相關(guān)。