賈躍進(jìn)常用治療失眠障礙藥對的作用機(jī)制分析*

彭雪峰，劉毅，趙飛，王瑞敏，張譯心，李菲，陳艷清，賈躍進(jìn)

1 山西中醫(yī)藥大學(xué) 山西太原 030024

2 山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 山西太原 030024

失眠障礙（Ⅰnsomnia Disorder，ⅠD）是最常見的一種疾病，其表現(xiàn)以入睡困難、頻繁覺醒或無法再眠，并且伴隨日間功能障礙為特征，是許多精神、軀體疾病的危險(xiǎn)因素。[1-2]但鑒于目前西藥的治療中存在一些令人擔(dān)憂的副作用和安全隱患，而中藥則相對副作用小，療效明顯，存在一定優(yōu)勢[1-3]。因此挖掘中藥可對失眠癥的藥物治療提供思路和參考。

賈躍進(jìn)主任醫(yī)師是第六批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作室指導(dǎo)老師，臨證40余年，尤擅應(yīng)用中藥治療包括失眠癥在內(nèi)的多種神經(jīng)、精神疾病。曾師從國醫(yī)大師呂景山，繼承其對藥調(diào)治疾病的學(xué)術(shù)思想，臨床用藥往往在辨證論治的基礎(chǔ)上，活用對藥治療各種疾病，常以菖蒲-郁金（CP-YJ）、丹參-元胡（DS-YH）、黃連-梔子（HL-ZZ）、酸棗仁-柏子仁（SZR-BZR）、百合-地黃（BH-DH）5個(gè)藥對配合使用治療失眠癥，取得了較好的療效。故本文根據(jù)中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)特性選取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究該5個(gè)藥對，以期為臨床使用及進(jìn)一步研究提供一定思路。

資料與方法

1 各藥對活性成分與靶點(diǎn)搜集

利 用TCMSP數(shù) 據(jù) 庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）（檢索關(guān)鍵詞：Herb Name分別是：郁金、丹參、元胡、黃連、梔子、酸棗仁、柏子仁、百合、地黃）檢索所有藥對中藥物的活性成分，按照OB（oral bioavailability）≥30%，BBB（blood brain barrier）≥-0.3，DL（drug—likeness）≥0.18進(jìn)行篩選，并根據(jù)中國知網(wǎng)（https：//www.cnki.net/）相關(guān)藥物文獻(xiàn)（檢索關(guān)鍵詞為：SU=菖蒲 OR 化學(xué)成分）最終確定藥物中確有作用的活性成分，然后結(jié)合TCMSP與Swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）得出藥物各活性成分的作用靶點(diǎn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中匹配基因名。

2 疾病靶點(diǎn)與藥對-疾病交集靶點(diǎn)搜集

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMⅠM（https：//omim.org/#）數(shù)據(jù)庫中檢索“insomnia disorder”以搜集疾病靶點(diǎn)，篩選后匹配Uniprot數(shù)據(jù)庫中的基因名。然后利用微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）確定各藥對與疾病的交集靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。

3 疾病-藥對-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作關(guān)系（PPⅠ）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以疾病、藥對、藥物、活性成分和靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，其相互關(guān)系為邊，在CytoscapeV3.6.1中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)將5個(gè)藥對與疾病的交集靶點(diǎn)分別導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）限定物種為智人，并利用Cytoscape軟件構(gòu)建PPⅠ網(wǎng)絡(luò)，利用內(nèi)置MCODE插件及網(wǎng)絡(luò)分析功能限定節(jié)點(diǎn)度值篩選PPⅠ網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)。

4 GO（Gene Ontology）富 集 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

在Metascape（https：//metascape.org/）數(shù)據(jù)庫平臺(tái)中導(dǎo)入1.2中5類交集靶點(diǎn)并分別進(jìn)行GO生物過程、分子功能及細(xì)胞成分富集分析和KEGG通路富集分析，然后利用在線作圖平臺(tái)微生信平臺(tái)及ⅠmageGP（http：//www.ehbio.com/ⅠmageGP/）繪制GO富集條形圖及KEGG通路富集氣泡圖。

5 核心成分和核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

取疾病-藥對-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度＞2倍中位數(shù)的核心有效成分和核心PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度大于中位數(shù)的核心靶點(diǎn)，利用PDB（http：//www.rcsb.org/）及Zinc（http：//zinc.docking.org/）數(shù)據(jù)庫分別獲得核心靶點(diǎn)和核心成分的3D結(jié)構(gòu)，預(yù)處理后應(yīng)用Autodock vina分子對接，并在Pymol中可視化結(jié)果。

結(jié) 果

1 藥對活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)搜集結(jié)果

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫、查閱中國知網(wǎng)，并限定OB、BBB、DL值篩選活性成分，其結(jié)果如表1所示。其中菖蒲-郁金、丹參-元胡、黃連-梔子、酸棗仁-柏子仁、百合-地黃活性成分各13、93、24、17、10種，而5個(gè)藥對分別匹配得相關(guān)靶點(diǎn)各：351、230、176、166、166個(gè)。

表1 各藥對主要活性成分基本信息

2 疾病靶點(diǎn)與藥物-疾病交集靶點(diǎn)搜集結(jié)果

在GeneCards、OMⅠM數(shù)據(jù)庫中檢索失眠癥靶點(diǎn)，將其合并去重后，共得到失眠癥靶點(diǎn)994個(gè)。將1.1中5個(gè)藥對靶點(diǎn)分別與其取交集，如圖1，得到交集靶點(diǎn)分別：89、67、49、44、52個(gè)。

圖1 藥對-疾病交集靶點(diǎn)

3 疾病-藥對-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPⅠ網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

疾病-藥對-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果如圖2所示，圖中包含772個(gè)節(jié)點(diǎn)，3167條邊。利用Cytoscape分析網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算節(jié)點(diǎn)度，篩選網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度＞2倍中位數(shù)的核心成分。然后將2.2中藥對-疾病交集靶點(diǎn)分別導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，得出以靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，蛋白相互作用為邊的5個(gè)網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape內(nèi)置的MCODE插件以及網(wǎng)絡(luò)分析功能篩選各網(wǎng)絡(luò)中的核心網(wǎng)絡(luò)以及節(jié)點(diǎn)度大于中位數(shù)的核心靶點(diǎn)，核心網(wǎng)絡(luò)見圖3。最后得到菖蒲-郁金藥對核心成分為：CP4、CP3、YJ3、YJ4、YJ6、YJ7及A，核心靶點(diǎn)為：DRD2、HTR2C、OPRM1、DRD4、ADRA1A、HTR5A；丹參-元胡藥對核心成分為：DS6、DS42、DS43、D、H，核心靶點(diǎn)為：DRD2、FOS、SLC6A4、MAOA、CRH、ACHE、HTR3A；黃連-梔 子的 核 心 成 分為：ZZ1、ZZ6、A、D、H，核心靶點(diǎn)為：FOS、VEGFA、ⅠL6、ⅠL1B、MMP2、MMP9；酸棗仁-柏子仁的核心成分為：SZR5、BZR1，核 心 靶 點(diǎn) 為：ADRA1A、APP、GRM5、CASR；百合-地黃的核心成分為：BH3、A、D，核心靶點(diǎn)為：OPRM1、ADRA1A、APP、ADRA2A、ADRA2C、F2。

圖2 疾病-藥對-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPⅠ網(wǎng)絡(luò)圖

4 GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

將疾病靶點(diǎn)與藥物-疾病交集靶點(diǎn)搜集結(jié)果中所得5類交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，其中菖蒲-郁金—失眠癥的GO富集分析共得1296條結(jié)果，包括突觸信號、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、節(jié)律過程、GABA能的突觸傳遞等生物過程，神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、激素結(jié)合等細(xì)胞功能，以及枝晶、突觸膜、膜筏等細(xì)胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得89條通路，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、血清素能突觸、晝夜節(jié)律等通路；丹參-元胡—失眠癥的GO富集分析共得1062條結(jié)果，包括行為、化學(xué)突觸傳遞、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、單胺運(yùn)輸、GABA能的突觸傳遞等生物過程，神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、腎上腺素受體活性、類固醇結(jié)合等分子功能，以及突觸膜、GABA-A受體復(fù)合物、軸突等細(xì)胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得49條通路，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、血清素能突觸等通路；黃連-梔子—失眠癥的GO富集分析共得828條結(jié)果，包括循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、化學(xué)突觸傳遞、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平等生物過程，腎上腺素受體活性，神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、類固醇結(jié)合等分子功能，以及突觸前膜、膜筏等細(xì)胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得63條通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、TNF信號通路、多巴胺能突觸等通路；酸棗仁-柏子仁—失眠癥的GO富集分析共得690條結(jié)果，包括行為、MAPK級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控、單胺運(yùn)輸?shù)壬镞^程，腎上腺素受體活性、單胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等分子功能，以及膜筏、突觸后膜的組成部分等細(xì)胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得38條通路，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、血清素能突觸等通路；百合-地黃—失眠癥的GO富集分析共得755條結(jié)果，包括行為、細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)等生物過程，神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、腎上腺素受體活性等分子功能，以及突觸后膜、GABA-A受體復(fù)合物等細(xì)胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得41條通路，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸等通路。然后篩選p值＜0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子＞1.5的富集項(xiàng)，分別繪制GO富集結(jié)果圖和KEGG富集氣泡圖，如圖4、5。然后分別以交集靶點(diǎn)、通路、疾病及各藥對為節(jié)點(diǎn)，其相互關(guān)系為邊構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，以直觀表明四者關(guān)聯(lián)，如圖6，其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路的基因比、基因計(jì)數(shù)及q值都較大程度比其他通路高，因此可認(rèn)為該5對藥對均最可能藉由此通路對失眠癥作用。

圖4 GO富集分析結(jié)果

圖6 疾病-靶點(diǎn)-通路關(guān)系圖

5 核心成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

疾病靶點(diǎn)與藥物-疾病交集靶點(diǎn)搜集結(jié)果中篩選得到的核心成分與核心靶點(diǎn)對接結(jié)果皆小于-5 kcal·mol-1，可見所有核心成分與核心靶點(diǎn)的組合都可形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表2。再取與每個(gè)藥對對接最穩(wěn)定的組合運(yùn)用Pymol對其構(gòu)象可視化，其中灰色部分為靶點(diǎn)，綠色部分為成分分子，其余各色標(biāo)記殘基，并顯示名稱，黃色虛線為氫鍵，并標(biāo)距離，見圖7。

表2 核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

圖7 對接較好的核心成分與核心靶點(diǎn)的分子對接構(gòu)象

討 論

失眠癥，中醫(yī)稱之為“不寐”?！鹅`樞》云：“夫衛(wèi)氣者，晝?nèi)粘Ｐ杏陉?，夜行于陰，故陽氣盡則臥，陰氣盡則窹”。[4]確立了“陽不入陰，陰陽失交”的總病機(jī)，賈躍進(jìn)老中醫(yī)結(jié)合其總病機(jī)以及朱丹溪的“六郁”學(xué)說，從而認(rèn)為氣、血、痰、火、濕、食等“郁”壅塞氣道，阻遏氣機(jī)，以致營衛(wèi)失合，陽不入陰，則發(fā)為不寐，并將“調(diào)氣”作為治療不寐的大法，并常以化痰安神的菖蒲-郁金、活血安神的丹參-元胡、清心安神的黃連-梔子、養(yǎng)血安神的酸棗仁-柏子仁、養(yǎng)陰安神的百合-地黃配合疏肝行氣解郁的方劑從“郁”論治不寐?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦表明這些藥物均可在抗抑郁、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、腦保護(hù)等方面發(fā)揮作用[5-11]。所以該5個(gè)藥對從中醫(yī)理論和現(xiàn)代研究來看，確可治療失眠癥。而在賈師實(shí)際應(yīng)用中亦效如桴鼓，切有較多的驗(yàn)案與經(jīng)驗(yàn)類文獻(xiàn)對其療效與應(yīng)用進(jìn)行了報(bào)道[12]。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

根據(jù)本文構(gòu)建的疾病-藥對-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)所得的核心活性成分來看，CP3、CP4是來自CP中的揮發(fā)油類，對其大量研究證實(shí)其存在抗焦慮、抗抑郁、抗癲癇、神經(jīng)保護(hù)等廣泛神經(jīng)系統(tǒng)作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)其可增加γ-氨基丁酸（GABA）受體陽性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間[13]；YJ3、YJ4、YJ6、YJ7屬于郁金的揮發(fā)油成分，該類成分在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被報(bào)道可顯著改善小鼠的工作記憶和空間學(xué)習(xí)記憶能力[14]；DS6可以通過激活ERK和GSK-3β信號來減輕低膽堿能神經(jīng)傳遞引起的認(rèn)知障礙[15]；DS43是DS中的三萜類物質(zhì)，其被報(bào)道具有多方面的神經(jīng)保護(hù)作用，如可通過p-p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）減弱新生大鼠的神經(jīng)炎癥，以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和減少NADPH氧化酶和iNOS的表達(dá)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]；ZZ1是一種五環(huán)三萜，被認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的一些疾病中具有治療潛力，包括：認(rèn)知障礙、抑郁、焦慮等[18]；ZZ6則被認(rèn)為存在抗炎的作用，而其作用可能與組胺，5-羥色胺（5-HT），激肽和前列腺素的釋放有關(guān)[19]；SZR5是酸棗仁的主要活性成分，可調(diào)節(jié)GABA受體亞基mRNA的表達(dá)，下調(diào)腸粘膜系統(tǒng)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的分泌，而影響大腦神經(jīng)細(xì)胞之間的細(xì)胞間細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)以發(fā)揮其鎮(zhèn)靜催眠作用[20]；BZR1屬于花生酸，該物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中有重要作用，包括睡眠誘導(dǎo)，增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)和突觸可塑性以及抗炎和神經(jīng)保護(hù)等[21]；D、A、H是藥物共有的成分，可見藥對之間存在一定的協(xié)同作用，其中成分D在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被驗(yàn)證可上調(diào)谷胱甘肽、GABA水平，下調(diào)多巴胺（DA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、乙酰膽堿酯酶（AChE）等的水平調(diào)節(jié)精神癥狀、改善腦功能[22]；成分A則可抑制TNF-α而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦驗(yàn)證其可增加小鼠CNS中的去甲腎上腺素（NE），5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)而表現(xiàn)抗抑郁活性[23-24]。

通過PPⅠ網(wǎng)絡(luò)得出的核心靶點(diǎn)，其中OPRM1、DRD2、DRD4、ADRA1A、ADRA2A、ADRA2C、HTR3A、HTR5A、HTR2C、SLC6A4、MAOA、ACHE、CRH編碼的蛋白參與調(diào)控涉及E、NE、DA、5-HT、ACh等神經(jīng)遞質(zhì)，而這些神經(jīng)遞質(zhì)是已知的調(diào)控睡眠-覺醒的關(guān)鍵物質(zhì)[25]；ⅠL6、ⅠL1B所編碼的蛋白則參免疫調(diào)節(jié)，其中促炎性細(xì)胞因子ⅠL-1，ⅠL-6會(huì)增加非快速眼動(dòng)睡眠，而消炎性細(xì)胞因子ⅠL-4、ⅠL-10會(huì)降低睡眠時(shí)間[26]；MMP2、MMP9編碼基質(zhì)金屬蛋白酶，這類蛋白酶已被證明在大腦的許多生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用，特別是在一些學(xué)習(xí)和記憶過程及主要的神經(jīng)精神疾病中，例如精神分裂癥，癲癇癥和抑郁癥等[27]；VEGFA在研究中被表明可影響GABA能神經(jīng)元的發(fā)育[28]；FOS則被認(rèn)為與覺醒相關(guān)[29]；APP在睡眠中斷時(shí)會(huì)增加表達(dá)，從而增加阿爾茨海默癥的風(fēng)險(xiǎn)[30]；GRM5編碼谷氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體，在調(diào)節(jié)突觸可塑性和調(diào)節(jié)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)中起重要作用[31]。

總體來看GO富集分析所獲得的主要生物過程與KEGG通路富集分析得到的主要通路都分別集中在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、化學(xué)突觸傳遞、行為、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等生物過程以及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、膽堿能突觸等通路，可以看出這些藥對的主要機(jī)制應(yīng)是通過DA、5-HT、ACh等神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)的，與目前睡眠的神經(jīng)生理機(jī)制相吻合。而就分子對接結(jié)果來看，所有核心成分與核心靶點(diǎn)均能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，可一定程度驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果。

綜上所述，根據(jù)中醫(yī)理論、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及分子對接驗(yàn)證，可初步揭示賈躍進(jìn)老中醫(yī)治療失眠癥的常用藥對的核心成分和核心靶點(diǎn)以及其主要作用機(jī)制，所得結(jié)論可為進(jìn)一步研究和臨床的使用提供一定參考和依據(jù)。