復合乳酸菌發(fā)酵過程中枸杞果汁品質及抗氧化活性變化

黃寧馨，魯群，丁士勇，劉睿,2,向世利

1.華中農業(yè)大學食品科學技術學院/環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070；2.農業(yè)農村部華中都市農業(yè)重點實驗室，武漢 430070； 3.湖北枸杞珍酒業(yè)有限公司，恩施445300

枸杞(LyciumbarbarumL.)是我國傳統的藥食同源植物，具有抗衰老、保護神經、抗疲勞、抗糖尿病、保肝、免疫調節(jié)、抗腫瘤活性等多種功能作用[1]。湖北雜交枸杞是以寧夏栽培枸杞誘導加倍，再與華夏枸杞(湖北當地野生枸杞)雜交后成功選育出的品種，改變了寧夏枸杞直接引種江漢平原產生不耐漬、不耐濕、發(fā)生嚴重根腐及黑果的問題，后被引進湖北建始[2]，開創(chuàng)了枸杞南方規(guī)?；N植的先河。目前在建始縣種植面積已達467 hm2，是當地經濟發(fā)展的支柱產業(yè)，但湖北雜交枸杞水分含量高，不耐貯藏，且不易加工成干制品[3]，亟需進行精深加工，一方面提高枸杞鮮果的加工轉化率，另一方面確保果農的收益，而采用乳酸菌發(fā)酵開發(fā)健康飲品將為其精深加工提供一種有益的嘗試。

乳酸菌是一類利用碳水化合物發(fā)酵產生大量乳酸的細菌，廣泛存在于人和動物腸道,以及泡菜等傳統發(fā)酵制品中。果蔬汁中富含糖類、有機酸、多酚、維生素等多種營養(yǎng)成分及生物活性物質，是乳酸菌理想的發(fā)酵基質。已有研究表明，乳酸菌發(fā)酵對果蔬汁生物活性物質組成和含量、功能活性及感官風味等方面均具有積極作用[4]。苦瓜汁經過植物乳桿菌發(fā)酵能增加產品中有機酸、總酚的含量，降低皂苷含量，使抗氧化活性增強。而植物乳桿菌發(fā)酵柿子果汁使其具有更強的激活醇脫氫酶、乙醛脫氫酶及抑制血管緊張素轉化酶活性，從而表現出較強的解酒和降血壓作用[5]。且相比單菌發(fā)酵而言，復合乳酸菌發(fā)酵更能賦予果蔬汁獨特的風味和豐富的營養(yǎng)功能[6-7]。關于乳酸菌發(fā)酵枸杞汁的研究目前主要集中在菌株篩選及發(fā)酵工藝等方面，如喬博鑫等[8]以感官評分為指標探討了枸杞汁最佳發(fā)酵工藝條件；李佩佩等[9]比較了乳酸菌與酵母菌以不同發(fā)酵方式結合發(fā)酵對枸杞汁主要成分的影響。而發(fā)酵過程中枸杞果汁糖、有機酸及酚類物質等營養(yǎng)成分以及產品風味變化的研究少有文獻報道。

因此，本研究在前期乳酸菌發(fā)酵枸杞果汁菌株篩選及工藝優(yōu)化的基礎上，研究湖北雜交枸杞果汁經植物乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌復合發(fā)酵過程中營養(yǎng)、風味和抗氧化特性的變化，以期為乳酸菌發(fā)酵枸杞果汁飲料的開發(fā)和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湖北雜交枸杞鮮果，湖北枸杞珍酒業(yè)有限公司；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)LP90、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum) LF61，江蘇微康生物科技有限公司。

果糖、葡萄糖、蔗糖，國藥集團化學試劑有限公司；草酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、原兒茶酸、兒茶素、對羥基苯甲酸、楊梅素、蘆丁、3-羥基肉桂酸、阿魏酸，均為HPLC級，上海源葉生物科技有限公司；蘆丁、Trolox(維生素E衍生物)及1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈，Fisher Chemical公司。

1.2 儀器與設備

低溫高速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；pHi510 pH 計，美國貝克曼公司；UV-Vis 分光光度計，日本 SHIMADZU 公司；20AD 高效液相色譜儀，日本Shimadzu 公司；UltiMate 3000超高效液相色譜儀，美國 Thermo Fisher 公司；HP6890/5975C 氣質聯用儀，美國 Agilent Technologies 公司；攪拌機，飛利浦家庭電器(珠海)有限公司；全波長酶標儀，美國 Thermo Fisher 公司；HTX 多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1)發(fā)酵工藝流程。挑選飽滿、無腐爛的枸杞鮮果，清洗，按料液質量比1∶3加水榨汁，添加3%蔗糖，經90 ℃水浴15 min滅菌，冷卻至室溫。2種乳酸菌菌粉分別接種到滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2代后以5 000 r/min離心15 min，使用無菌生理鹽水清洗3次后,各制得植物乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌的種子液，再以體積比為 2 ∶ 1混合2種菌的種子液，以4%接種量接種到枸杞果汁中，37 ℃發(fā)酵54 h，發(fā)酵過程中每隔18 h取樣測定。

2)理化指標和微生物學特性的測定。活菌數：采用平板稀釋法，參考 GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》；pH值：采用 pH 酸度計測定。

3)糖的測定。參考Peng等[10]方法，利用高效液相色譜儀測定。色譜條件:Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，流動相80%乙腈，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL，檢測器為示差折光檢測器。

4)有機酸的測定。參考文獻[11]方法，利用高效液相色譜儀測定。色譜條件:Hypersil Gold aQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相0.02 mol/L磷酸二氫胺(磷酸調節(jié)pH值至2.7)，柱溫30 ℃，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長210 nm，檢測器為二極管陣列檢測器。

5)酚類物質的測定。參考文獻[12]的方法，并略作修改。①提取方法：取2 mL枸杞果汁，加入3倍體積的乙酸乙酯分別萃取3次，合并上清液，氮吹至干后加入200 μL色譜甲醇溶解，0.22 μm濾膜過濾后進樣。②液相色譜條件：Hypersil Gold C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相A為0.13%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，體積流量 1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量 20 μL，檢測波長為 280 nm。梯度洗脫程序：0 ～ 10 min，5%～12% B; 10～15 min，12% ～16%；15～30 min，16%～20%B；30～40 min，20%～30% B；40～50 min，30%～35% B；50～60 min，35%～50%；60～70 min，50%～95%。

6)揮發(fā)性成分的測定。①樣品的萃取。稱取枸杞果汁6.5 g于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭的手動進樣器，在65 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min時間后，移出萃取頭并立即插入GC-MS進樣口中解析5 min。②GC-MS條件。色譜條件：色譜柱為HP-5MS(60 m×0.25 mm,0.25 μm)，程序升溫：42 ℃保持 2 min，以3.5 ℃/min 升至 189 ℃，再以 8 ℃/min升至 278 ℃。載氣為He，體積流量1 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，設置溶劑延遲時間3 min。質譜條件：離子源為EI，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓2 129 V；接口溫度280 ℃；掃描范圍m/z29～500。③數據處理。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist17和Wiley275標準質譜圖，用峰面積歸一化法進行各種香氣成分相對含量的計算。

7)抗氧化活性的測定。①DPPH自由基清除率的測定參考Mousavi等[13]方法。②總還原力的測定參考Wang等[14]的方法。③ORAC的測定,參照Herández-ledesma等[15]方法。

2 結果與分析

2.1 復合乳酸菌發(fā)酵過程中枸杞果汁活菌數和pH的變化

活菌數和pH值是評價乳酸菌在枸杞果汁中生長情況和發(fā)酵力的重要指標，其結果見圖1。由圖1可知，在發(fā)酵18 h時，乳酸菌在枸杞果汁中大量生長繁殖，同時pH值由5.07降至3.27。隨著發(fā)酵時間的延長，體系中營養(yǎng)物質不斷消耗及代謝產物的積累，36 h后枸杞果汁中活菌數顯著降低(P<0.05)。

圖中不同小寫字母表示不同組之間差異顯著(P<0.05)。下同。Data with different superscript letters were significantly different (P<0.05).The same as below.

2.2 復合乳酸菌發(fā)酵對枸杞果汁糖含量的影響

復合乳酸菌發(fā)酵枸杞果汁過程中果糖、葡萄糖、蔗糖的變化如圖2所示，在發(fā)酵進行到18 h時，原料中添加的蔗糖被乳酸菌完全分解、利用，同時由于蔗糖的分解速度高于乳酸菌的消耗，生成部分葡萄糖和果糖。18 h后，乳酸菌利用葡萄糖和果糖作為碳源生長繁殖，發(fā)酵結束后果糖、葡萄糖含量分別降低了45.58%、29.86%。

圖2 枸杞果汁發(fā)酵過程中果糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖(C)含量的變化Fig.2 Changes of fructose(A),glucose(B) and saccharose(C) content during fermentation of Goji juice

2.3 復合乳酸菌發(fā)酵對枸杞果汁有機酸的影響

復合乳酸菌發(fā)酵枸杞果汁過程中有機酸的變化見圖3。隨著發(fā)酵的進行，枸杞汁中草酸、蘋果酸、檸檬酸含量顯著降低(P<0.05)，尤其是發(fā)酵前期。蘋果酸在枸杞果汁中含量較低，僅為19.07 mg/100 mL，在發(fā)酵過程中乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵使蘋果酸向乳酸轉變，發(fā)酵54 h后含量降至8.63 mg/100 mL。檸檬酸是枸杞果汁中含量最為豐富的有機酸，在復合乳酸菌發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化，發(fā)酵到36 h時，檸檬酸含量降至最低(9.72 mg/100 mL)。草酸在枸杞果汁中含量為63.88 mg/100 mL，在復合乳酸菌生長代謝過程中被轉化利用，發(fā)酵結束后降至47.38 mg/100 mL。乳酸、乙酸、γ-氨基丁酸在復合乳酸菌發(fā)酵過程中不斷增加。其中，乳酸是復合乳酸菌發(fā)酵的主要代謝產物，發(fā)酵結束后占有機酸總量的59.97%。乙酸在枸杞果汁中含量較低，初始含量為10.59 mg/100 mL，隨發(fā)酵時間的增加不斷增加，54 h后含量增至154.26 mg/100 mL。γ-氨基丁酸經復合乳酸菌發(fā)酵后含量增加了1.82倍。

2.4 復合乳酸菌發(fā)酵對枸杞果汁酚類物質的影響

采用高效液相色譜法對復合乳酸菌發(fā)酵過程中枸杞果汁中酚類物質組成和含量進行檢測，酚類物質標準圖譜及發(fā)酵前后枸杞果汁酚類物質液相色譜圖見圖4，結果如表1所示。結果表明，乳酸菌發(fā)酵可以改變枸杞果汁中酚類物質組成和含量。原兒茶酸在未發(fā)酵枸杞果汁中未檢出，經發(fā)酵后含量增至40.55 μg/100 mL。經復合乳酸菌發(fā)酵后，枸杞果汁中的對羥基苯甲酸、兒茶素、3-羥基肉桂酸和楊梅素含量顯著增加，蘆丁在發(fā)酵過程無顯著性變化。阿魏酸和香草酸含量較初始分別降低了66.62%、62.72%。

A:草酸 Oxalic acid； B：γ-氨基丁酸 GABA; C:蘋果酸 Malic acid; D:乳酸 Lactic acid; E:乙酸 Acetic acid; F:檸檬酸 Citric acid.圖3 枸杞果汁發(fā)酵過程中有機酸含量的變化Fig.3 Changes of the content of organic acid during fermentation of Goji juice

A:混合標準品 Mixed standard products; B：發(fā)酵前 Before fermentation; C:發(fā)酵后 After fermentation.1～10分別代表原兒茶酸、兒茶素、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸、蘆丁、阿魏酸、3-羥基肉桂酸、楊梅素、槲皮素。1-10 represent protocatechuic acid,catechin,p-hydroxybenzoic acid,vanillic acid,p-coumaric acid,rutin,ferulic acid,3-hydroxycinnamic acid,myricetin and quercetin，respectively.

表1 枸杞果汁發(fā)酵過程中酚類物質含量的變化 Table 1 Changes of volatile constituents during fermentation of Goji juice μg/100 mL

2.5 復合乳酸菌發(fā)酵對枸杞果汁揮發(fā)性成分的影響

揮發(fā)性成分是果蔬汁重要的感官特性指標，可以影響消費者的選擇。本研究利用SPME-GC/MS對枸杞果汁發(fā)酵不同時間的樣品進行揮發(fā)性成分測定，得到的揮發(fā)性風味物質相對含量及種類見表2。在枸杞果汁發(fā)酵過程中共鑒定出18種物質，包括3種醛、4種醇、4種酯、3種酮、1種酸、1種烯烴和2種其他類物質。醛類物質具有較低的香氣閾值，對枸杞果汁風味具有重要影響。己醛、苯甲醛和β-環(huán)檸檬醛是枸杞果汁中鑒定出的3種醛類物質。其中，在發(fā)酵過程中己醛相對含量不斷降低，在36 h后未檢出，而β-環(huán)檸檬醛和苯甲醛經發(fā)酵后相對含量增加。1-辛烯-3-醇是枸杞果汁中鑒定出的主要醇類物質，隨發(fā)酵時間的增加其相對含量不斷降低，經乳酸菌發(fā)酵后新生成了乙醇、1-己醇、芳樟醇3種醇類物質。酯類物質是一類對風味有重要影響的化合物，在本研究中，乳酸菌發(fā)酵未使枸杞果汁酯類物質的種類發(fā)生改變。水楊酸甲酯是發(fā)酵與未發(fā)酵枸杞果汁中的主要酯類物質，伴有冬青葉香與果香味。乙酸乙酯的增加主要來自于乙酸和乙醇的酯化反應，發(fā)酵54 h后其相對含量增加了3.28倍，提升了枸杞果汁的果香味。枸杞果汁中的酮主要為香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮，占酮類物質總量的93.93%，經復合乳酸菌發(fā)酵后均出現降低。檸檬烯發(fā)酵結束后其相對含量是枸杞果汁的4.57倍。

表2 枸杞果汁發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分變化 Table 2 Changes of volatile constituents during fermentation of Goji juice

2.6 復合乳酸菌發(fā)酵枸杞果汁過程中抗氧化的變化

利用DPPH自由基清除率、總還原力和ORAC法對發(fā)酵過程中的枸杞果汁抗氧化活性進行評價，結果如圖5所示。乳酸菌發(fā)酵可以顯著提高枸杞果汁的抗氧化活性。其中，DPPH自由基清除力隨發(fā)酵時間延長而不斷提高，發(fā)酵54 h時較初始提高了21.42%。而總還原力和ORAC值在36 h達到最大，發(fā)酵結束后分別提高了14.18%、51.75%。

為了進一步確定枸杞果汁抗氧化活性變化與酚類物質的關系，對發(fā)酵過程中9種酚類物質與3種體外抗氧化活性進行相關性分析,其結果見表3。由表3可知，DPPH自由清除率與原兒茶酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)，與兒茶素、3-羥基肉桂酸、楊梅素含量呈顯著正相關(P<0.05)，ORAC值與楊梅素含量呈顯著正相關(P<0.05)。由此可見，乳酸菌發(fā)酵枸杞果汁引起的抗氧化活性的增強，可能與酚類物質的釋放和相互轉化相關。

A:DPPH自由基清除率； B:總還原力； C:氧化自由基吸收能力。A:DPPH free radical scavenging rate; B:Total reducing power; C:ORAC.

表3 枸杞果汁發(fā)酵過程中酚類物質與抗氧化活性的相關性分析 Table 3 Correlation analysis of phenolics and antioxidant activity during fermentation of Goji juice

3 討 論

糖類是乳酸菌在生長過程中的主要碳源和能量來源，不同乳酸菌對糖的代謝因菌株、發(fā)酵時間和底物類型的不同而有所差異[16]。在本研究中，乳酸菌發(fā)酵18 h時已將枸杞果汁中添加的蔗糖利用完全，發(fā)酵后期僅利用葡萄糖、果糖進行生長繁殖。有機酸是乳酸菌發(fā)酵過程中的主要代謝產物，在體內不僅可以抑制有害菌的生長，提高人體對鈣、磷等無機物的吸收，對于維持發(fā)酵產品風味也發(fā)揮重要作用。復合乳酸菌發(fā)酵后乳酸的大量生成主要是碳水化合物經糖酵解和6-磷酸葡萄糖酸內酯途徑轉化產生，本研究中使用的異型發(fā)酵乳酸菌，其代謝產物除乳酸外還會有乙酸等物質的生成，從而賦予枸杞果汁更為豐富的口感。在乳酸菌發(fā)酵過程中存在蘋果酸-乳酸途徑，使枸杞果汁中的蘋果酸含量顯著降低。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產物，在發(fā)酵過程中含量降低可能是由于復合乳酸菌將其轉化生成雙乙酰、乳酸、乙酸等物質[17]。γ-氨基丁酸是人體內重要的抑制性神經遞質，具有多種生理功能，本研究中經復合乳酸菌發(fā)酵后其含量增加了1.82倍。在乳酸菌發(fā)酵馬齒莧、黑莓汁等研究中γ-氨基丁酸均有所增加，其原因一方面是果蔬組織受外界刺激生成，另一方面來自于乳酸菌代謝產生[18-19]。此外，研究表明在高酸性環(huán)境下更能促使乳酸菌產生γ-氨基丁酸。這可能是發(fā)酵后期具有更高水平γ-氨基丁酸的原因[20]。

酚類物質是枸杞果汁中重要的活性成分，與枸杞果汁的多種功能活性密切相關。筆者所在課題組前期研究發(fā)現乳酸菌發(fā)酵可以顯著提高枸杞果汁中總酚、總黃酮含量。本研究進一步利用HPLC分析發(fā)現湖北雜交枸杞汁在復合乳酸菌發(fā)酵過程中酚類物質組成和含量發(fā)生明顯變化。研究表明，乳酸菌發(fā)酵過程中產生的蛋白酶、葡萄糖苷酶等酶，可以釋放出與細胞壁上的多糖和蛋白質結合的酚類物質。Liu等[21]研究發(fā)現多菌發(fā)酵可以促進枸杞汁中結合態(tài)對羥基苯甲酸的釋放，此外，植物乳桿菌產生的脫羧酶也可以將對香豆酸代謝為對羥基苯丙酸或對羥基苯甲酸，這可能是對羥基苯甲酸含量大量增加而對香豆酸含量降低的原因。楊梅素含量的增加可能與乳酸菌將一些黃酮糖苷轉化為游離性的黃酮苷元有關。研究表明植物乳桿菌產生的脫羧酶和還原酶可以將阿魏酸代謝為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等風味前體物質，使得阿魏酸含量降低[22]。

發(fā)酵果汁中揮發(fā)性物質的組成和含量對于產品的感官品質至關重要，許多研究表明乳酸菌發(fā)酵可以增加果汁揮發(fā)性物質的種類和含量。Ricci等[23]用乳酸菌發(fā)酵櫻桃汁后發(fā)現揮發(fā)性化合物的總量較發(fā)酵前有所增加，主要表現為萜烯類、酮類、醇類、酸類等物質含量的增加。在本研究中，復合乳酸菌發(fā)酵增加了枸杞果汁中揮發(fā)性物質種類及醇類、酸類和烯烴類物質的含量。其中，乙醇、1-己醇、芳樟醇和乙酸是復合乳酸菌發(fā)酵后新增加的揮發(fā)性物質，乙醇具有令人愉快的醇香味，主要是由糖酵解生成的丙酮酸在丙酮酸甲酸裂解酶、乙醛脫氫酶、醇脫氫酶的作用下生成，它在發(fā)酵18 h時相對含量最高，發(fā)酵后期略有降低，可能是與酸結合生成了酯類物質有關[24]。1-己醇的產生可能與脂氧合酶途徑有關，該物質具有水果的芳芬。芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類，香氣閾值低，賦予枸杞果汁甜的鈴蘭香味。乙酸是經乳酸菌發(fā)酵產生的揮發(fā)性酸，主要通過磷酸葡萄糖酸途徑和檸檬酸的代謝產生，研究發(fā)現與其他乳酸菌相比，乳桿菌發(fā)酵果蔬汁揮發(fā)性成分中具有更高的乙酸含量，賦予果汁理想的酸味[25]。β-環(huán)檸檬醛具有清爽的薄荷香和果香，經發(fā)酵后該物質相對含量增加，對枸杞果汁風味有一定的輔助作用。苯甲醛主要由色氨酸或苯丙胺酸經轉氨酶的作用產生，隨著濃度的增加，苯甲醛會產生櫻桃的香甜味[26]。檸檬烯是檸檬、胡柚、柑橘等水果中含量最高的揮發(fā)性成分，在發(fā)酵過程中由于乳酸菌產生糖苷酶，將鍵合態(tài)烯類釋放成游離態(tài)使得該物質含量不斷增加，賦予枸杞果汁清新的橘子香氣[27]。己醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃等物質隨發(fā)酵時間延長不斷降低，其中，己醛具有脂肪和青草的風味，濃度過高會產生酸敗的氣味，而1-辛烯-3-醇具有土腥味和蘑菇味，研究結果表明復合乳酸菌發(fā)酵可以降低枸杞果汁的青草味和腥味，增加令人愉悅的花果等香味。

果蔬汁經過乳酸菌發(fā)酵不僅促使膳食多酚的轉化，改變有機酸的組成和含量，還可以顯著提高枸杞果汁的DPPH自由基清除力、總還原力和ORAC抗氧化活性。劉秋豆等[28]研究也發(fā)現，使用植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌復合發(fā)酵芒果汁可顯著提高其ABTS自由基清除力和總還原力。果蔬汁的抗氧化活性與其含有的酚類化合物有關，研究表明，一些乳酸菌能夠通過產生酚酸脫羧酶、糖基水解酶或酯酶將酚類化合物轉化為生物活性更好的衍生物[29]。而本研究相關性分析表明，發(fā)酵枸杞果汁抗氧化活性的增強與原兒茶酸、兒茶素、楊梅素、3-羥基肉桂酸含量的增加呈顯著相關。

因此，本研究表明以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)為菌種的復合乳酸菌發(fā)酵可以提高枸杞果汁中膳食多酚等活性成分含量和抗氧化活性，改變其有機酸的組成和含量，賦予其令人愉悅的花果香等風味，為開發(fā)風味良好與營養(yǎng)俱佳的乳酸菌發(fā)酵枸杞飲料提供實驗依據和理論支撐。但本研究也存在一定局限性，有關枸杞乳酸菌飲料產品穩(wěn)定性及口感調配在今后的工作中仍需進一步深入研究。