腸道微生物對疫苗免疫效果影響的研究進展

陳斯謙 吳邊 柳陳堅 李曉然

（1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；2. 云南省第一人民醫(yī)院 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，昆明 650032）

疫苗作為一類通過激活機體免疫系統(tǒng)發(fā)揮預(yù)防、治療作用的藥物而受到廣泛使用。其在進入體內(nèi)后會對機體免疫系統(tǒng)進行刺激，引起免疫應(yīng)答，進而導(dǎo)致免疫細胞分化等過程，對個體產(chǎn)生保護作用。在該系列過程中，由于個體差異等因素，機體所使用的疫苗并不能如期地發(fā)揮作用。腸道微生物是居住在宿主腸道中的微生物總稱，因其對宿主生長發(fā)育等過程具有重要作用而被稱為人類第二基因組。近年來對于腸道微生物與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的領(lǐng)域研究備受關(guān)注，大量文獻表明腸道微生物對宿主免疫系統(tǒng)各個過程有著重要作用，并且影響著宿主免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答；此外，腸道微生物還能夠?qū)C體服用的藥物進行代謝，這都可能影響疫苗的藥效。本文系統(tǒng)總結(jié)了腸道微生物對于疫苗作用效果影響的研究進展。

1 微生物對疫苗的作用概述

1.1 腸道菌群概述

腸道菌群是在宿主腸道中居住的微生物總稱，其組成在宿主整個生命歷程中呈現(xiàn)一定的變化趨勢。在兩歲以前宿主腸道微生物群落組成呈現(xiàn)無規(guī)律變化［1-2］，這種變化主要受飲食、抗生素使用、病毒感染、分娩方式（順產(chǎn)，剖腹產(chǎn)）以及環(huán)境潔凈度影響［3-4］。隨著宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，宿主腸道微生物群落會在門的組成水平上趨于穩(wěn)定［1-2］，并以放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）以及軟壁菌門（Tenericutes）為主［5］。各門的比例以及當(dāng)中微生物的組成受宿主基因組，外界環(huán)境，飲食等因素影響而存在差異，進而影響宿主免疫以及代謝。

1.2 特定腸道菌群對疫苗效果的影響

研究表明特定的微生物類群會影響疫苗的效果，多見于口服疫苗相關(guān)研究中，如屬于腸道中腸桿菌-擬桿菌屬（Enterobacteria-Bacteroides）的類群以及解沒食子酸鏈球菌（Streptococcus gallolyticus），雙歧桿菌科中的長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)的longum亞種和infantis亞種這些微生物與疫苗口服后宿主免疫應(yīng)答以及免疫細胞的豐度呈正相關(guān)，而腸道中的擬桿菌門，屬于變形菌門的假單胞菌目（Pseudomonadales）則相反［6-7］。這類臨床研究的缺陷在于僅報道特定菌群與接種疫苗后免疫應(yīng)答的強弱相關(guān)性而沒有作更為深入的機理研究。

1.3 益生菌對疫苗的影響

在眾多類型的腸道微生物中，益生菌被研究得較多，大量文獻報道其對宿主腸道具有調(diào)控作用。益生菌是腸道中存在的一大類微生物總稱，它們能對宿主產(chǎn)生益生的生理特性。益生菌包括酪酸梭菌，乳酸菌，酵母，放線菌，雙歧桿菌，嗜酸乳桿菌等［8］。我們先前研究發(fā)現(xiàn)，由乳桿菌（Lactobacillus）發(fā)酵制成的功能食品能夠明顯改善腸道運輸，并且能夠改變腸道菌群的組成，這表明益生菌對腸道的功能具有較大影響，服用益生菌后能夠使腸道微生物群落朝著有利于宿主健康的方向發(fā)展［9-10］。

益生菌能夠?qū)δc道免疫系統(tǒng)進行調(diào)控，部分益生菌（乳桿菌，雙歧桿菌，鏈球菌以及乳酸菌）已被證實能夠激活或抑制宿主體內(nèi)的MAPK及NF-κb這兩條免疫相關(guān)的主要通路而影響宿主免疫應(yīng)答［11］。另一方面，與疫苗引起免疫應(yīng)答相關(guān)的免疫球蛋白（Ig）亦受到相關(guān)益生菌的調(diào)控。如干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）可以增加宿主小腸固有層總的slgA水平，以及IL-6，并且不產(chǎn)生由益生菌所誘導(dǎo)的特異性的slgA［12］。在一項關(guān)于輪狀病毒感染的實驗發(fā)現(xiàn)，給予小鼠雙歧桿菌（雙叉雙歧桿菌（Bifidobacterium biofidum），嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infant））處理后，小鼠病毒感染率顯著降低，并且腸道黏膜針對輪狀病毒特異性IgA的抗體滴度增加［12］。此外，另有報道表明腸道中的益生菌提高了宿主疫苗特異性 IgG（IgG1 和 IgG3）含量［13］，并且腸道中雙歧桿菌占優(yōu)勢時可能會在增強嬰兒胸腺發(fā)育和對口服和注射疫苗的反應(yīng)［7］。值得關(guān)注的是，上述研究表明宿主并不會對益生菌產(chǎn)生特異性的Ig將細菌清除，這有可能歸功于益生菌本來就是正常腸道中存在的有益菌群，除了不會受到腸道免疫系統(tǒng)的攻擊外還對宿主免疫發(fā)育作出貢獻。相反，有了益生菌對宿主免疫系統(tǒng)的輔助，宿主在受到抗原（如疫苗）刺激后，引起了更加激烈的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更加大量的，針對抗原的特異性漿細胞、記憶細胞以及Ig，從而提高了應(yīng)答效應(yīng)。

1.4 抗生素使用與無菌環(huán)境

腸道菌群會影響疫苗效用，而抗生素以及無菌環(huán)境不存在于正常的腸道微生物群落。越來越多運用抗生素以及無菌動物進行的研究顯示這類特殊的腸道環(huán)境會對宿主免疫系統(tǒng)造成影響。結(jié)腸處的能量代謝很大程度上依賴于腸道菌群，而腸道免疫系統(tǒng)成熟過程中需要大量的能量來滿足細胞分化，成熟，遷移以及分泌相關(guān)免疫調(diào)控細胞因子，缺乏菌群的小鼠結(jié)腸細胞表現(xiàn)出能量缺乏狀態(tài)，包括TCA循環(huán)，丙酮酸脫氫復(fù)合酶的活性降低［14］。而這種腸道狀態(tài)會對體內(nèi)其他免疫器官的發(fā)展造成損傷，包括免疫細胞類型豐度、淋巴組織發(fā)育和對病原體敏感性［15］。在這種缺乏腸道菌群的腸道環(huán)境中，宿主小腸和結(jié)腸常常伴隨著樹突狀細胞、CD4+細胞，CD8+T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞（FoxP3+）、Th1細胞（IFNγ+）和B細胞減少［16］，并且腸道中對于抗病毒起關(guān)鍵作用的 IL-1b、TNF-a 、 IL17以及IgA等細胞因子減少。這預(yù)示著缺乏微生物的腸道對于抗原的刺激敏感性較低，因此可能難以對疫苗產(chǎn)生正常應(yīng)答。宿主健全的免疫系統(tǒng)成熟以及發(fā)揮正常功能需要穩(wěn)定健全的腸道微生物群落存在，而無菌或抗生素處理后的腸道環(huán)境會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)發(fā)展受阻。

關(guān)于上述特殊腸道環(huán)境對疫苗應(yīng)答鮮有報道，但有研究表明抗生素造成免疫系統(tǒng)缺損導(dǎo)致了疫苗不能正常發(fā)揮療效。流感疫苗是當(dāng)今最普遍的一類疫苗，宿主抗生素的服用會打破腸道微生物群落的穩(wěn)定，而機體過往獲得的抗流感病毒免疫力的抗體反應(yīng)會因此而減弱。此外，腸道菌群因抗生素而導(dǎo)致的紊亂會導(dǎo)致血清次級膽汁酸減少，這種現(xiàn)象與 AP-1/NR4A 信號和炎癥體激活高度相關(guān)，并且還觀察到服用抗生素以及正常人群兩組由疫苗產(chǎn)生的IgG1 應(yīng)答存在差異［17］。這項研究表明宿主在缺少腸道中某些微生物的作用，導(dǎo)致了以往接受了抗原刺激的記憶B細胞作用減弱，間接減弱了以往注射疫苗的效用。但這種對于記憶B細胞減弱的效應(yīng)是由于腸道微生物的缺失導(dǎo)致的細胞數(shù)量損失還是記憶B細胞激活后產(chǎn)生的抗體減少導(dǎo)致的還有待更為深入的研究。

2 腸道微生物對疫苗作用的可能途徑

2.1 腸道微生物可能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)影響疫苗效果

腸道微生物對于疫苗的效應(yīng)很有可能是其產(chǎn)生的次生代謝物作用結(jié)果。人類腸道中定居著種類繁多的微生物，因此其代謝類型也具有多樣性。而報道得較多的是腸道微生物通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA）以及膽汁酸而對宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用（圖 1）。

圖1 腸道微生物通過影響宿主免疫系統(tǒng)進而影響疫苗作用效果的可能路徑Fig.1 The possible pathways of affecting vaccine effects in intestinal microorganism by affecting the host immune system

2.2 腸道微生物可能會對疫苗產(chǎn)生直接作用

2.1.1 短鏈脂肪酸 哺乳動物體內(nèi)的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）以乙酸、丙酸和丁酸含量最高。擬桿菌門和厚壁菌門是腸道中最豐富的門，擬桿菌門的成員主要產(chǎn)生乙酸鹽和丙酸鹽，而厚壁菌門主要在人體腸道中產(chǎn)生丁酸鹽［18］。據(jù)前所述，腸道中擬桿菌門與厚壁菌門的豐度與疫苗產(chǎn)生的特異性免疫相關(guān)，因此推測是此類腸道微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸作用于宿主免疫系統(tǒng)進而影響了該過程。SCFAs可直接調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)并維持其穩(wěn)態(tài)，其主要通過與短鏈脂肪酸受體GPR43結(jié)合誘導(dǎo)中性粒細胞趨化和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）的增殖；介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受109A（GPR109A）的活化誘導(dǎo)Treg分化；誘導(dǎo)腸上皮細胞的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）表達間接使B細胞分泌的免疫球蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)化并導(dǎo)致IgA的產(chǎn)生或通過GPR43誘導(dǎo)醛脫氫酶家族1成員A2（ALDH1A2）表達，進而促進B細胞分泌IgA［19-20］。這3個方面進行的，形成了腸道微生物（擬桿菌門與厚壁菌門）-短鏈脂肪酸-免疫系統(tǒng)-抗原這一調(diào)控軸。而疫苗作為抗原的一類，進入人體后必然會引起該調(diào)控軸的反應(yīng)。

2.1.2 膽汁酸 膽汁酸是機體膽固醇分解代謝產(chǎn)生的一類膽烷酸衍生物，腸道中參與膽汁酸代謝的微生物包括擬桿菌，梭菌、乳酸菌、雙歧桿菌和李 斯 特 菌（Bacteroides，Clostridium，Lactobacillus，Bifidobacterium，Listeria）［21-22］。在此過程中，游離至腸道的膽汁酸受到腸道菌群的作用而轉(zhuǎn)化為膽汁酸代謝物，并由腸道菌群維持著兩者的平衡。目前認為該過程是通過調(diào)控核膽汁酸受體FXR和質(zhì)膜受體TGR5進行的［23］。膽汁酸水解酶則是眾多微生物酶其中重要的一種，其可將結(jié)合型膽汁酸轉(zhuǎn)化為非結(jié)合型膽汁酸或通過磺化、氧化、差向異構(gòu)、脫羥基等催化修飾直接改變膽汁酸結(jié)構(gòu)［24］。而微生物作用后的膽汁酸產(chǎn)物通過維生素D影響著腸道RORγ+Treg的數(shù)量，這一細胞類群常被認為在機體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著主要作用［23，25］。此外，小鼠實驗顯示IgA漿細胞能夠從腸道中發(fā)生轉(zhuǎn)移，并且腸道中的RORγ+ Treg與 IgA 水平呈現(xiàn)負相關(guān)［26-27］，這表明上述的細菌類群對疫苗的影響存在一條通路，即上述微生物類群通過FXR和TGR5對膽汁酸的代謝進行調(diào)控，生成的膽汁酸代謝影響著RORγ+ Treg類群的豐度，進而對機體中疫苗作用于免疫細胞產(chǎn)生的IgA含量產(chǎn)生影響。

腸道微生物會對宿主體內(nèi)藥物進行修飾，許多從中藥里分離的有效成分被認為需要經(jīng)過腸道微生物的結(jié)構(gòu)修飾變?yōu)榛钚詷?gòu)象發(fā)揮療效［28］，而藥物經(jīng)腸道微生物和酶的作用常發(fā)生脫糖基、脫甲基、脫羥基、水解、氧化還原等反應(yīng)［29-30］，導(dǎo)致在腸道中活性增強，失活或產(chǎn)生毒副作用［31-32］。許多中藥成分在經(jīng)過腸道菌群的作用后活性會得以提高，例如人參中主要的原人參二醇型皂苷-人參皂苷Rb1，通過腸道微生物逐步去糖基化為化合物K和20（S）-原人參二醇，這兩種物質(zhì)都被實驗證明具有比人參皂苷Rb1更好的生物利用度和生物活性［33］。

口服疫苗直接與人體小腸黏膜接觸，通過黏膜上皮細胞表達II類主要組織相容性抗原（MCH）進行抗原轉(zhuǎn)運和呈遞，抗原傳遞給I類T輔助性淋巴細胞（Th1），促使B淋巴細胞分泌型IgA抗體，形成細胞毒淋巴細胞及記憶型細胞。IgA型抗體由黏膜上皮細胞轉(zhuǎn)送至腸道或呼吸道內(nèi)，阻止外來病原微生物結(jié)合；IgA抗體也可以通過補體和抗體介導(dǎo)的細胞毒性作用參與病原微生物的殺傷和清理［34］。雖然腸道微生物直接修飾疫苗成分的研究尚未報導(dǎo)，但推測口服類疫苗會受到腸道微生物的直接作用。并且因其通過小腸吸收發(fā)揮作用，所以受小腸中的微生物影響較大。從總體上講，許多疫苗的本質(zhì)是碳水化合物這一大類物質(zhì)，包括多糖類疫苗，而腸道菌群特別適合對藥物進行糖苷水解，因為許多細菌門，特別是擬桿菌門和厚壁菌門，它們都編碼有豐富的糖苷水解酶基因，因此含有糖苷鍵的藥物或輔料在暴露在腸道環(huán)境中極易被降解。此外，這種對于糖苷鍵的分解并不是靠某一類微生物進行一次加工完成的，細菌在多糖發(fā)酵中常常發(fā)揮協(xié)同作用，通過在無菌小鼠腸道上單一定植真桿菌（Eubacterium rectale），多形芽孢桿菌（Bacillus thetaiotaomicron）或兩者共同定植建立的人類腸道微生物群的簡化模型揭示了這種協(xié)同作用。在真桿菌，多形芽孢桿菌相互共存的腸道環(huán)境中，真桿菌上調(diào)了自身許多糖苷水解酶的表達，而直桿菌下調(diào)了其聚糖降解酶的產(chǎn)生，但卻上調(diào)了寡糖和單糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達。當(dāng)處于共定居狀態(tài)時，多形芽孢桿菌專注于多糖降解，而直形芽孢桿菌專注于對多形芽孢桿菌產(chǎn)生的多糖降解產(chǎn)物的進一步加工［35］。這一互動提示了上述兩種細菌對于口服多糖等疫苗可能存在連續(xù)性的降解作用（圖2），導(dǎo)致部分失活，降低其生物利用度，因此在生產(chǎn)工藝中需考慮這種降解作用，對具有糖苷鍵的疫苗進行糖基化以防治糖苷鍵水解或加以特定佐劑用作保護。

圖2 多糖類口服疫苗作用原理及小腸中的微生物對其降解作用Fig. 2 Reaction principle of polysaccharide oral vaccine and its degradation by microorganisms in small intestine

3 腸道微生物影響宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育

腸道微生物會影響宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育，而疫苗作用的原理是通過特定的抗原激活機體特異性免疫應(yīng)答，這需要宿主免疫系統(tǒng)的參與。近年來越來越多報道證明腸道微生物對宿主免疫系統(tǒng)表型構(gòu)造以及免疫應(yīng)答起著重要作用，這類作用常被認為主要通過上述短鏈脂肪酸、丁酸鹽及維生素等物質(zhì)發(fā)揮的功效。腸道微生物在生命的早期已存在，我們之前的研究結(jié)果顯示人體至少在胎兒時期就已暴露在有菌環(huán)境，在所有胎便樣品中，變形菌門（Proteobacteria）豐度最高，而由上文得知，腸道中的變形菌門豐度與口服疫苗的活性呈負相關(guān)，這表明孕期胎兒的腸道環(huán)境對于口服疫苗的藥效會產(chǎn)生負面作用；除了一般的細菌外還存在產(chǎn)甲烷古生菌（Methanobrevibacter），這一以往被認為是腸道不健康的指示菌種［36］。在生命早期，宿主免疫系統(tǒng)還未成熟且缺乏適應(yīng)性免疫的情況下，腸道微生物分泌未知的代謝物通過STAT3磷酸化以IL-23和IL-22依賴的方式激活上皮內(nèi)淋巴細胞（IEL）和固有淋巴樣細胞3（ILC3），宿主則通過IL-23，ILC3，IL-22和IEC形成反饋回路調(diào)控腸道微生物群，保持了早期生命免疫系統(tǒng)與腸道菌群的動態(tài)平衡。

隨著生命周期推進，腸道微生物的豐度提高，并隨著小腸近端到直腸遠端的順序逐漸遞增，大量的腸道微生物定植在宿主結(jié)腸隱窩處，與宿主腸上皮細胞相鄰。而腸上皮細胞被認為是免疫細胞的一種［37］，能夠?qū)λ拗髅庖呦到y(tǒng)進行調(diào)節(jié)［38］以及直接與菌群相互作用，如腸道某些特定菌株（Segmented filamentous，Bacteroides fragilis）能夠通過與腸道上皮細胞接觸引起一系列的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腸道T細胞亞群改變，招募末端回腸中Th17細胞的積聚，并通過細胞的TLR2通路進而促進 Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細胞的發(fā)育等作用［39-40］。這些研究再一次表明了腸上皮細胞是微生物與宿主免疫系統(tǒng)以及疫苗與微生物間接互作的媒介以及傳導(dǎo)使者。

腸道微生物除了能夠維持宿主免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)以外，還能參與宿主免疫系統(tǒng)修復(fù)。在一項通過骨髓移植而重構(gòu)化療破壞的免疫系統(tǒng)的癌癥患者隊列研究中發(fā)現(xiàn)，腸道中的糞桿菌屬（Faeclibacterium），瘤胃球菌屬（Ruminococcus）以及阿克曼菌屬（Akkermansia）的組合能夠明顯增加血液中的白細胞數(shù)量，進而說明了這3個屬的某些微生物可能存在一定的串聯(lián)式協(xié)同互作，通過某一通路來重新激活，修復(fù)宿主免疫系統(tǒng)。此外，除了這3個微生物類群以外，部分能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸，細胞壁分子以及能夠介導(dǎo)膽酸鹽降解，維生素B1合成以及丁酸鹽形成的微生物亦與骨髓移植后患者體內(nèi)白細胞數(shù)目相關(guān)［41］，而執(zhí)行這類功能的微生物通常被認為是正常人體腸道中占主導(dǎo)的菌群。以往也有相當(dāng)數(shù)量的關(guān)于正常人體或正常實驗動物的腸道菌群移植到患病動物體內(nèi)的實驗，這些研究內(nèi)容涉及癌癥，老年癡呆，皮膚移植等方向，結(jié)果或多或少表明了正常的腸道菌群能夠改善患病動物的癥狀，但這些研究缺乏相應(yīng)的腸道代謝組數(shù)據(jù)。根據(jù)患病動物在接受移植后的腸道微生物組成，我們大致可以相信這兩者腸道的代謝情況是相當(dāng)?shù)?，進而可以大體認為恢復(fù)正常的腸道微生物產(chǎn)生的代謝物有助于患病宿主恢復(fù)，包括對宿主免疫系統(tǒng)的修復(fù)。由此可見，腸道微生物維系了宿主正常的免疫環(huán)境，而這也是疫苗發(fā)揮作用的前提。

4 展望

隨著系統(tǒng)生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展以及組學(xué)測序的普及，使我們能夠更深入，系統(tǒng)地研究腸道微生物與宿主免疫的關(guān)系。相比于傳統(tǒng)研究方法，近年來興起的單細胞測序技術(shù)提高了免疫系統(tǒng)環(huán)境中各個過程的分辨率，使得研究能夠聚焦于宿主免疫中的微小變化；而宏基因組、蛋白組、16S測序技術(shù)也因技術(shù)的發(fā)展而使成本大大降低，得到普及。以上種種促使該領(lǐng)域在短短幾年內(nèi)迅速發(fā)展。腸道菌群對于宿主免疫成熟、恢復(fù)以及正常運行的作用不容小覷，該方向的研究為免疫治療、系統(tǒng)免疫藥物用藥提供了很好的指導(dǎo)。對于腸道微生物與疫苗之間的相互作用，近年來也被陸續(xù)報道，而該方向處于起步階段，有待后續(xù)研究闡明更深入的系統(tǒng)關(guān)系，腸道菌群對于新冠疫苗這一類通過免疫應(yīng)答發(fā)揮療效的藥物作用到底會造成何種影響，這也是值得探討的問題。但我們可以從過往研究中得到啟發(fā)，基于腸道菌群的作用對以往疫苗劑型進行改良以及疫苗研發(fā)的思考，使其能夠更好地在機體發(fā)揮療效以及減小毒副作用。·