實(shí)驗(yàn)牛微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測地方標(biāo)準(zhǔn)的研究和制定*

李昌文 朱遠(yuǎn)茂 夏長友 陳洪巖

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家禽類實(shí)驗(yàn)動物資源庫，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069)

實(shí)驗(yàn)動物作為生命科學(xué)的重要組成部分，不僅是國家科技創(chuàng)新的重要基礎(chǔ)條件之一，而且是科學(xué)研究不可或缺的手段，更是提升科技創(chuàng)新能力的支撐和保障[1]。標(biāo)準(zhǔn)化是實(shí)驗(yàn)動物的根本屬性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制體系中的重要組成部分，是實(shí)驗(yàn)動物微生物和寄生蟲控制水平的依據(jù)，也是對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行分級的根本依據(jù)[2]。黑龍江省不僅是養(yǎng)牛大省，也是使用牛進(jìn)行科研、生產(chǎn)、檢定、教學(xué)等各項(xiàng)科研教學(xué)活動較多的省份。因此，潛在的多種可能發(fā)生的人獸共患病給生物安全帶來了極大的威脅。同時(shí)，由于潛在的多種牛微生物和寄生蟲的存在，也會影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性和重復(fù)性。近年來，隨著使用實(shí)驗(yàn)牛數(shù)量逐年增加，這些風(fēng)險(xiǎn)正被逐漸的增大。目前，國內(nèi)還沒有與實(shí)驗(yàn)牛相關(guān)的國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，因此亟需編制黑龍江省實(shí)驗(yàn)牛微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 標(biāo)準(zhǔn)編制的背景

隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，實(shí)驗(yàn)牛的應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛,例如：(1)畜牧獸醫(yī)研究領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)牛作為獸用生物制品的原材料，同時(shí)也是獸用生物制品研發(fā)及產(chǎn)品檢驗(yàn)的必備工具；(2)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，利用轉(zhuǎn)基因牛乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白，利用轉(zhuǎn)基因奶牛改變牛奶成分，醫(yī)學(xué)研究中主要用乳牛來制備小牛血清，供免疫學(xué)研究用，還可選用健康的牛肌肉、肝臟和體液制備培養(yǎng)基；(3)比較醫(yī)學(xué)上應(yīng)用，成熟期牛的一些遺傳學(xué)異常作為人類遺傳學(xué)比較研究的模型，包括先天性原卟啉癥、神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、軟骨發(fā)育不全性侏儒癥、先天性毛發(fā)稀少癥、遺傳性白內(nèi)障、先天性甲狀腺腫瘤、先天性心臟病、遺傳代謝功能不全等。犢牛在體形和心臟的大小方面與人近似，常用于心血管外科研究。牛既可用于結(jié)核病、副結(jié)核病、布氏桿菌病等傳染病研究，還可用作代謝病方面如低血鈣、表皮角化癥和發(fā)育不全性貧血的研究；(4)科學(xué)研究與教學(xué)。

《黑龍江省人民政府關(guān)于加快現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的意見》黑政發(fā)[2015]25號文件指出，我省是畜牧大省，地處世界公認(rèn)的黑土帶、黃金玉米種植帶和黃金奶牛養(yǎng)殖帶，地域廣闊、土壤肥沃、氣候冷涼及環(huán)境優(yōu)良，發(fā)展畜牧產(chǎn)業(yè)具有得天獨(dú)厚的資源條件和區(qū)位優(yōu)勢。大力發(fā)展乳品業(yè)、奶牛、肉牛、生豬養(yǎng)殖及加工業(yè)。

黑龍江不僅是我國養(yǎng)牛業(yè)的重要基地，也是開展牛病研究的重要地區(qū)，包括眾多開展牛病研究的科研院所、大專院校及醫(yī)藥企業(yè)，如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)等。在牛病教學(xué)、牛病研究及與牛相關(guān)的疫苗生產(chǎn)、教學(xué)及其它科學(xué)研究中必然使用大量的實(shí)驗(yàn)牛，研究和生產(chǎn)用血清需求量更大。當(dāng)前，實(shí)驗(yàn)牛多是從市郊或周邊地區(qū)購買，其攜帶人獸共患病的病原微生物和寄生蟲情況不明，會帶來許多潛在危險(xiǎn)。

我國目前還沒有牛作為實(shí)驗(yàn)動物的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)研究與教學(xué)使用的牛，只是以外觀健康為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇。這些實(shí)驗(yàn)牛可能攜帶有多種傳染病和寄生蟲的病原體，甚至有的牛處于亞健康狀態(tài)，患有人畜共患病，用這種動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或科學(xué)研究，勢必會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至還能導(dǎo)致生物安全及公共衛(wèi)生安全問題。因此，開展實(shí)驗(yàn)牛的標(biāo)準(zhǔn)化及標(biāo)準(zhǔn)制定工作，對于提高科學(xué)研究與教學(xué)使用的實(shí)驗(yàn)牛質(zhì)量、提高科研結(jié)果的準(zhǔn)確性、確保人身安全以及應(yīng)對公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)也非常重要。

2 實(shí)驗(yàn)牛等級的設(shè)定

參照國內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)動物等級分類原則，結(jié)合實(shí)驗(yàn)牛的生產(chǎn)水平和實(shí)驗(yàn)要求，本標(biāo)準(zhǔn)按照微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)等級將實(shí)驗(yàn)牛劃分為普通級和SPF級，未設(shè)定清潔級，主要是根據(jù)國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動物專家的意見，考慮與國際實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)接軌。目前國際上按照實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)控制是實(shí)驗(yàn)動物分級的根本標(biāo)準(zhǔn)分為普通級、SPF級和無菌級，不包括清潔級。清潔級和SPF級實(shí)驗(yàn)牛的環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)一致，生產(chǎn)和使用成本相當(dāng)，在微生物和寄生蟲檢測項(xiàng)目上難以劃定。綜合上述因素，在本標(biāo)準(zhǔn)中，取消清潔級實(shí)驗(yàn)牛的設(shè)定。

3 檢測項(xiàng)目選取

3.1 需檢測項(xiàng)目的選擇

主要綜合考慮以下9方面：①普通級和SPF級牛的定義；②國家現(xiàn)行法律法規(guī)的要求；③生物安全；④黑龍江省內(nèi)牛微生物和寄生蟲病的流行病學(xué)情況[3-11]；⑤檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)以及檢測實(shí)驗(yàn)室的硬件條件；⑥臨近省份和國家的牛微生物寄生蟲病的流行情況[12-13]；⑦適用性和前瞻性；⑧實(shí)驗(yàn)牛的生產(chǎn)管理方式的改變；⑨輸入性微生物和寄生蟲病的防控和管理[14]。

3.2 普通級和SPF級實(shí)驗(yàn)牛寄生蟲檢測項(xiàng)目的選擇

參考上述9方面內(nèi)容，對普通級牛的檢測項(xiàng)目設(shè)置重點(diǎn)考慮人獸共患病以及2015版《中華人民共和國獸藥典》中的條款要求。普通級牛應(yīng)排除棘球蚴(Echinococcusspp.)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)、體外寄生蟲(Ectoparasitesspp.)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)、賈第蟲(Giardiaspp.)和梨形蟲(Piroplasmaspp.)。在《一、二、三類動物疫病病種名錄》和《中華人民共和國進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》中將棘球蚴病和弓形蟲病為二類動物疫病，是重要人獸共患寄生蟲病。根據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查研究資料得出，黑龍江省牛體表寄生蟲感染率很高，對牛的生長和發(fā)育影響極大。隱孢子蟲和賈第蟲病為人獸共患寄生蟲病，為GB 5749—2006《生活飲用水生活標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的唯一排除兩種寄生蟲病原?，F(xiàn)在，牛的飼養(yǎng)方式已經(jīng)發(fā)生較大變化，由原來的游牧式為主轉(zhuǎn)變?yōu)樯犸暈橹鳎Ｅc牛及人與牛的接觸時(shí)間加長，且水源地距離較近。綜合考慮，將以上兩種寄生蟲列入到普通級牛的檢測項(xiàng)目。牛梨形蟲在2015版《中華人民共和國獸藥典》中為必檢項(xiàng)目，在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中也被列為二類動物疫病。

在確定SPF級牛的檢測項(xiàng)目時(shí)，除普通級應(yīng)排除的病原體外，主要是選擇對動物生長發(fā)育影響較大(腹瀉病、血液病及繁殖障礙病)以及對實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大影響的病原體。根據(jù)已知的流行病學(xué)調(diào)查研究資料，黑龍江省牛共有體內(nèi)、外寄生蟲58種，其中蠕蟲(Helminths)35種，占60.34%；球蟲(Eimeriaspp.)感染率為17.33%，是重點(diǎn)排除的寄生蟲。除以上兩種寄生蟲外，牛錐蟲(Trypanosome)病在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中被列為二類動物疫病，牛滴蟲病(Bouine trichomoniasis)《一、二、三類動物疫病病種名錄》中被列為三類動物疫病，新孢子蟲病是由犬新孢子蟲(Neosporacaninum)寄生于多種動物而引起的，分布于世界各地，主要危害是引起孕畜流產(chǎn)或死胎以及新生兒的運(yùn)動神經(jīng)障礙。同時(shí)，對牛的危害尤為嚴(yán)重，是引起牛流產(chǎn)的主要原因。然而，綜合考慮，目前牛的飼養(yǎng)方式發(fā)生了較大的變化，因此需排除牛滴蟲和新孢子蟲引起繁殖障礙的寄生蟲病原體。

3.3 普通級和SPF級實(shí)驗(yàn)牛微生物檢測項(xiàng)目的選擇

目前我國牛病發(fā)生特點(diǎn)是發(fā)病率高、病原體耐藥性增強(qiáng)、人畜共患傳染病的幾率上升、肢蹄病、繁殖障礙性和呼吸系統(tǒng)疫病發(fā)生率較高、牛疫病種類增多、混合感染問題嚴(yán)重、診治難度增大等。根據(jù)上述牛病的發(fā)生特點(diǎn)和流行趨勢，確定普通級實(shí)驗(yàn)牛病原微生物檢測項(xiàng)目和檢測方法，主要排除攜帶的人獸共患病病原微生物和烈性傳染病病原微生物，具體檢測項(xiàng)目有口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus,FMDV)、布魯氏菌(Brucellaspp.)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)、鉤端螺旋體(Leptospirosisspp.)、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)及貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)[15-21]。

自2008年以來，我國牛群爆發(fā)嚴(yán)重的呼吸道疾病，表現(xiàn)為牛呼吸道疾病綜合征，抗生素治療效果不明顯、發(fā)病率高及死亡率高，給養(yǎng)牛業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。最近幾年我國肉牛及奶牛的存欄量持續(xù)下降，牛呼吸道病的爆發(fā)是主要原因之一。病原流行病學(xué)調(diào)查顯示存在多病原感染，其中主要原發(fā)病因?yàn)椴《拘圆≡?，包括牛副流感病?型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV-3)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea/Mucosal disease virus,BVDV)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)等。病毒感染呼吸道上皮細(xì)胞造成局部損傷，使呼吸道黏膜的防御能力下降，同時(shí)引起機(jī)體免疫抑制，繼發(fā)細(xì)菌/支原體感染，如多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)等，引起嚴(yán)重的肺炎，導(dǎo)致牛呼吸道疾病綜合征。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國牛副流感病毒3型血清陽性率達(dá)77.96%(2 960/3 797)，牛傳染性鼻氣管炎血清陽性率達(dá)46.03%(3 933/8 545)[22]。我國對牛副流感病毒3型和牛傳染性鼻氣管炎均未進(jìn)行免疫接種，高血清陽性率說明我國牛群中感染非常普遍。運(yùn)輸、氣候變化、混群等應(yīng)激因素常常導(dǎo)致牛呼吸道病原的感染，而作為實(shí)驗(yàn)牛經(jīng)歷運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素是必然的。另外牛病毒性腹瀉、牛副流感病毒3型、牛白血病病毒(Bovine leuknia virus,BLV)等可引起免疫抑制，感染后不宜作為實(shí)驗(yàn)牛，所以本標(biāo)準(zhǔn)排除牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、牛副流感病毒3型、牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌、牛呼吸道合胞體病毒及牛白血病病毒。犢牛腹瀉是養(yǎng)牛場飼養(yǎng)管理過程中面臨的最主要的奶牛健康問題之一，危害主要表現(xiàn)為飼料利用率下降、治療成本增加以及不同程度的死亡率，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。牛輪狀病毒(Bovine rotavirus，BRV)是引起犢牛腹瀉的最主要病原，發(fā)病率可高達(dá)50%～100%，7日齡以內(nèi)犢牛最為易感，典型癥狀為嚴(yán)重腹瀉、糞便呈水樣、色呈淡黃色、有時(shí)混有黏液和血液、犢牛脫水、眼凹陷、四肢無力、消瘦及臥地，感染后不再適合作為實(shí)驗(yàn)牛，故本標(biāo)準(zhǔn)把牛輪狀病毒列為排除的病原之一[23]。結(jié)合黑龍江省牛病流行特點(diǎn)確定實(shí)驗(yàn)牛SPF牛病原微生物檢測項(xiàng)目和檢測方法，除普通級應(yīng)排除的病原體外，排除不攜帶所規(guī)定的潛在感染或條件致病和對科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的微生物，具體包括牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、牛副流感病毒3型、牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌、牛呼吸道合胞體病毒、牛輪狀病毒、副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis)、胎兒彎曲桿菌(Campylobacterfetus)、牛白血病病毒和衣原體(Chlamydiaspp.)。

4 檢測方法

目前寄生蟲檢測方法較為成熟，實(shí)驗(yàn)室通用方法為蟲卵、蟲體及抗體水平的測定，即通過對實(shí)驗(yàn)牛的分泌物、排泄物、毛發(fā)、皮膚等樣品收集處理，直接進(jìn)行蟲卵或蟲體的形態(tài)學(xué)檢查，確定是否體外寄生蟲等存在。對采集的血液進(jìn)行血清學(xué)診斷，通過抗體水平判定弓形蟲(Toxoplasmagondii)等是否感染牛體。本標(biāo)準(zhǔn)所涉及病原的檢測，均參照相關(guān)的國標(biāo)或行標(biāo)，具體檢測方法，參照表1所列。

表1 實(shí)驗(yàn)牛寄生蟲檢測方法

在本次地標(biāo)制定中，對實(shí)驗(yàn)牛進(jìn)行微生物檢測。首先選擇有國標(biāo)或行標(biāo)的檢測方法，未有以上標(biāo)準(zhǔn)的，使用經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所牛羊傳染病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建立驗(yàn)證的方法。牛副流感病毒3型Real-time PCR診斷方法、牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌多重PCR診斷方法、牛呼吸道合胞體病毒套式Real-time PCR檢測方法、牛輪狀病毒多重半套式Real-time PCR檢測方法為本單位牛羊傳染病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供的切實(shí)可行的方法，這些方法均適用于我國上述牛流行病原的檢測，具有敏感性高及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并經(jīng)當(dāng)?shù)貦z測和診斷應(yīng)用表明上述診斷方法準(zhǔn)確可靠。具體檢測方法參照表2。

表2 實(shí)驗(yàn)牛病原微生物檢測方法

5 預(yù)期社會效益

本標(biāo)準(zhǔn)的制定可為我省農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)動物新資源提供標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)保障和為公共衛(wèi)生乃至生物安全提供重要的基礎(chǔ)條件支撐，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物資源建設(shè)領(lǐng)域、關(guān)鍵技術(shù)問題的突破并提升實(shí)驗(yàn)動物科技工作對科技發(fā)展與創(chuàng)新的支撐能力和水平。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施可為動物養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)性發(fā)展起到推動作用，為重大動物疫病研究提供高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)動物并為生物制品的研發(fā)、生產(chǎn)及檢定提供標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動物。不僅增強(qiáng)生物制品的核心競爭力，推動我國傳統(tǒng)生物制品產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級，提升我國相關(guān)產(chǎn)業(yè)競爭力和國際影響力，進(jìn)而帶動我省乃至我國畜牧業(yè)行業(yè)技術(shù)進(jìn)步及健康發(fā)展，確保阻斷人畜共患病對人類健康的影響，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)、社會健康及持續(xù)發(fā)展具有重要意義。不僅如此，還為我國生命科學(xué)領(lǐng)域的研究及產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供重要的支撐條件，對解決動物、動物產(chǎn)品及生物制品的技術(shù)瓶頸具有重要意義。

6 討論

現(xiàn)行的《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》第二條中規(guī)定：標(biāo)準(zhǔn)包括國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)及企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。國家標(biāo)準(zhǔn)分為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)及推薦性標(biāo)準(zhǔn)。行業(yè)及地方標(biāo)準(zhǔn)是推薦性標(biāo)準(zhǔn)，賦予了地方標(biāo)準(zhǔn)明確的法律地位。第十三條規(guī)定：為滿足地方自然條件、風(fēng)俗習(xí)慣等特殊技術(shù)要求，可以制定地方標(biāo)準(zhǔn)，地方標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)具有地方的特色。黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動物牛微生物學(xué)等級及監(jiān)測》和《實(shí)驗(yàn)動物牛寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》的研究和制定就是充分考慮到黑龍江省特殊的地理位置和氣候條件并結(jié)合實(shí)驗(yàn)牛的主要傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律而制定的，比如流行性出血熱和血吸蟲病是牛的烈性傳染病，但是由于我省特殊的地理生態(tài)條件，這兩種病原體均未列為檢測項(xiàng)目。

充分的收集和整理流行病學(xué)資料，做好深入的調(diào)研和分析是制定實(shí)驗(yàn)牛微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)的重要前提。目前，我省正在大力推進(jìn)“兩牛一豬”項(xiàng)目，近幾年來從國外引進(jìn)的奶牛和肉牛的數(shù)量較大，這給輸入性動物疫病的防控帶來了極大的壓力和隱患。同時(shí)，目前我國畜牧業(yè)的發(fā)展趨勢是產(chǎn)能北移及產(chǎn)品南移，這將會造成人流和動物流的頻繁交叉，給國內(nèi)動物疫病的流動提供了便利。由于時(shí)間和能力所限，針對上述發(fā)生的現(xiàn)象，標(biāo)準(zhǔn)編制小組調(diào)查分析做的還不夠充分，使得本標(biāo)準(zhǔn)的前瞻性顯得不強(qiáng)。