LC-MS/MS法測定肉豆蔻中玉米赤霉烯酮含量的不確定度評定

倪 倩，張 俐，馮有龍

（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京 210019）

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻（Myristica fragransHoutt.）的干燥種仁[1]。味辛、溫，具有溫中行氣、澀腸止瀉的功效。肉豆蔻的主要成分為揮發(fā)油和脂肪油等，若貯存不當(dāng)，極易發(fā)生霉變，產(chǎn)生真菌毒素[2-3]。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的非甾體雌激素真菌毒素，是真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有良好的熱穩(wěn)定性。玉米赤霉烯酮可導(dǎo)致人體產(chǎn)生免疫系統(tǒng)受損、內(nèi)分泌紊亂和肝腎功能不全[4]。因此，檢測肉豆蔻中的玉米赤霉烯酮具有重要意義。

由于測量誤差不可避免，不確定度則表示了對測量結(jié)果不能肯定的程度，也可表明測量結(jié)果的可信賴程度[5-6]。本文參考《測量不確定度評定與表示》[5]與《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[6]對標(biāo)準(zhǔn)溶液配制擬合過程、樣品稱量過程、樣品前處理過程進(jìn)行評估，合成拓展不確定度，為肉豆蔻中玉米赤霉烯酮的檢測提供更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器

ExionLC型超高效液相色譜儀，AB QTRAP 4500 LC/MS/MS（美國SCIEX公司）；CPA0045型萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；TG16-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)。

1.2 試劑

混合真菌毒素對照品溶液（含玉米赤霉烯酮2.0 μg/ml，純度99.9%，批號S075901），購自阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密量取0.5 mL混合真菌毒素對照品溶液，置100 mL量瓶中，用50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得線性1號溶液。精密量取線性1號溶液各1 mL，分別置2 mL、5 mL、10 mL與20 mL量瓶中，用50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得線性2、3、4與5號溶液。

1.3.2 樣品處理

取本品粉末約5 g（過二號篩），精密稱定，精密加入70%甲醇溶液50 mL，超聲處理30 min，離心，精密量取上清液10 mL，用水稀釋至20 mL，搖勻。精密量取3 mL，緩慢通過已經(jīng)處理好的HLB柱[規(guī)格：3 mL（60 mg）]，依次用甲醇和水各3 mL洗脫，直至有適量空氣通過，收集洗脫液；隨后用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，合并2次洗脫液，氮?dú)饩徛抵两?，?0%乙腈溶液定容至1 mL，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取濾液。

1.3.3 色譜質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。采用Phenomenx Titank色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），流動相A為0.01%甲酸，流動相B為甲醇-乙腈（1∶1），梯度洗脫。洗 脫 程 序 為 0～ 2.0 min，5%B；2.0～ 2.1 min，5%B ～ 40%B；2.1～ 8.0 min，40%B～ 90%B；8.0～10.0 min，90%B；10.0～12.0 min，90%B～5%B。流速0.4 mL·min-1，柱溫40 ，進(jìn)樣體積5 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI源），負(fù)離子方式檢測，離子化電壓-4 500 V；離子源溫度（TEM）700 ，噴霧氣（GS1）、輔助加熱氣（GS2）和氣簾氣（CUR）壓力分別為 55 psi、60 psi和 35 psi；碰撞氣（CAD）Medium，MRM掃描模式，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 玉米赤霉烯酮質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

試樣中玉米赤霉烯酮的含量表示為：

式中：X-試樣中玉米赤霉烯酮含量，μg/kg；c-試樣溶液中玉米赤霉烯酮含量，ng；m-樣品稱樣量，g；P-標(biāo)準(zhǔn)溶液影響因子；curve-標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合影響因子。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 不確定度分量來源

本次試驗(yàn)的不確定度分量包括標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程、樣品稱量過程、樣品前處理過程。

2.3 各分量不確定度的計(jì)算評定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

（1）玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度urel(S)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為5%（k=2），可知玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程的引入不確定度u(P)。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中，所用到的玻璃量器為2 mL、5 mL、10 mL、20 mL與100 mL量瓶各1個，0.5 mL與1 mL移液管各1個。根據(jù)JJG196—2006常用玻璃量器可知最大允差，具體見表2。假設(shè)分布類型為三角分布（k=），可計(jì)算出由2 mL量瓶和1 mL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其他玻璃量器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算見表2。

表2 玻璃量器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由玻璃量器引入的不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程的引入不確定度為：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(curve)

由實(shí)驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=33 207.7x-5 046.0，r=0.998 6（n=5），則有a=-5 046.0，b=33 207.7。

式中：X-樣品測量的平均濃度，1.05 ng/mL；P-樣品測量的次數(shù)，p=2；n-標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)，n=5；-標(biāo)準(zhǔn)曲線平均濃度，3.70 ng/mL；xi-標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)，ng/mL；yi-標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的峰面積；yi′-擬合曲線計(jì)算的峰面積。

將表3中的參數(shù)代入式（2）（3），得到：SA=7 914.53，urel(curve)=0.058 1

表3 擬合曲線相關(guān)值

2.3.3 樣品稱量引入的不確定度u(m)

稱取試樣質(zhì)量為5.000 0g，電子分析天平的最大允差為±0.000 1 g，按矩形分布k=計(jì)算，樣品稱量過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 樣品前處理引入的不確定度u(c)

本實(shí)驗(yàn)方法的提取過程涉及到溶劑定量提取和定量濃縮，所以樣品處理過程引入不確定度的主要來源為3 mL、10 mL和50 mL移液管；1 mL和20 mL量瓶。

（1）移液管引入的不確定度。根據(jù)JJG196—2006常用玻璃量器可知最大允差，具體見表4。

表4 移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

假設(shè)分布類型為三角分布，可計(jì)算出由3 mL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

以此類推，其他移液管的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算結(jié)果見表4，可得由移液管引入的不確定度為：

（2）量瓶引入的不確定度。根據(jù)JJG 196—2006常用玻璃量器可知最大允差，具體見表5。

表5 量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

假設(shè)分布類型為三角分布，可計(jì)算出由1 mL量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

以此類推，其他量瓶的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算結(jié)果見表5，可得由移液管引入的不確定度為：

綜上，樣品前處理引入的不確定度為：

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與拓展

3.1 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合各分量可得合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度U(X)

肉豆蔻中玉米赤霉烯酮的含量為6.8 μg/kg，相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 擴(kuò)展不確定度U

擴(kuò)展不確定度U取置信概率為95%，包含因子k=2，則肉豆蔻中玉米赤霉烯酮的擴(kuò)展不確定度為：

試樣中玉米赤霉烯酮的測量結(jié)果為：

4 結(jié)論

通過整個分析過程可知，本次實(shí)驗(yàn)中不確定度的最大影響因素為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及擬合過程，而其他分量引入的不確定度均影響較小。為避免不確定度增大，可選擇資質(zhì)較齊全、標(biāo)準(zhǔn)不確定度較低的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)使用已校正的A類玻璃量器，也可增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)測定次數(shù)。另外，也要加強(qiáng)操作人員的培訓(xùn)，提高實(shí)驗(yàn)技能熟練度，將人為誤差降至最低。