一株產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及其生物特性研究

陳佩 閆娟 黨輝

[摘 要]本研究從陜西漢中泡菜汁中分離篩選出一株可產(chǎn)γ -氨基丁酸（GABA）的乳酸菌P16，并對其生物特性進行了研究。結(jié)果表明：該菌株GABA的產(chǎn)量為0.796 mg/mL;該菌株生長較快，培養(yǎng)2 h進入對數(shù)生長期，12 h后進入穩(wěn)定期;菌株具有良好的耐酸性和耐鹽性，在pH值達到2或NaCl濃度達到9%（W/V）時仍然可以存活，最適生長pH為6-7;菌株耐受膽鹽的延遲時間可達0.94 h。通過形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，確定該菌株為短乳桿菌Lactobacillus brevis，將其命名為Lactobacillus brevis P16。本研究為高產(chǎn)GABA乳酸菌發(fā)酵劑的開發(fā)和應用提供了理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]乳酸菌;γ-氨基丁酸;生物特性

[中圖分類號] TS201.3 [文獻標識碼] A [文章編號]1008-4649（2021）04-0089-06

Screening for a Lactic Acid Bacteria Producing γ-Aminobutyric Acid and Study on the Biological Properties

Chen Pei1，Yan Juan1，Dang Hui2

（1. The Open University of Shaanxi，Xi’an 710119;2.Shaanxi Normal University，Xi’an 710119）

Abstract：In this study，a lactic acid bacterium P16 that can produceγ-aminobutyric acid （GABA） was isolated and screened from pickle juice in Hanzhong，Shaanxi，and its biological characteristics were studied. The results showed that the output of its GABA is 0.796 mg/mL. The results showed that the growth cycle of the strain was relatively short，it entered the logarithmic growth phase at 2 hours，and reached stationary phase after 12 hours. The strain has good acid fastness and salt tolerance. It could grow under pH2 and 9% NaCl（ W/V） conditions. The optimum pH and temperature for its growth was 6-7.The bile tolerance of this strain in the form of lag time was 0.94 h. Through morphological observation and molecular biological identification，the strain was determined to be Lactobacillus brevis，and it was named Lactobacillus brevis P16. This study provides a theoretical basis for the development and application of high-yield GABA lactic acid bacteria starter.

Key words：Lactic acid bacterium; GABA; Biological properties

γ-氨基丁酸，可簡稱為GABA，又稱為氨酪酸，是一種廣泛分布于自然界的非蛋白質(zhì)氨基酸。在哺乳動物體內(nèi)只存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化由谷氨酸轉(zhuǎn)化而成[1]，具有抗疲勞、降血壓[2]、改善睡眠以及提高人體記憶力[3]等生理功能，是一種兼具藥理作用和保健功能的新型功能因子，現(xiàn)已被國家衛(wèi)生部批準為“新資源食品”，可用于巧克力、可可制品、糖果、飲料、膨化和焙烤食品中，在食品領(lǐng)域具有良好的應用前景。GABA的制備方法主要包括植物富集法、化學合成法及微生物合成法三類，相比較而言，植物富集法產(chǎn)量低、成本高且難度大，化學合成法反應復雜且安全性差，而微生物發(fā)酵合成法成本低、安全性較好且條件溫和，適用于大規(guī)模生產(chǎn)制備，是較為理想的合成方法[4]。

乳酸菌是可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的一類細菌統(tǒng)稱，作為世界公認的食品安全級益生菌被廣泛應用于泡菜和酸奶等發(fā)酵食品的生產(chǎn)制作，通常情況下泡菜汁中存在著大量乳酸菌。近年來，乳酸菌的有益作用越來越受到人們的關(guān)注，大量試驗結(jié)果表明，乳酸菌具有促進腸道消化、降血壓血糖[5-6]、提高人體免疫能力[7]、降低人體膽固醇[8]和抗腫瘤[9]等功能，不同種屬的乳酸菌往往具有不同的益生功能[10]。目前，已有不少研究表明在酸奶、土壤、腌制酸菜等材料中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)GABA的乳酸菌株。如李遠宏[11]等人從鮮奶中篩選出一株高產(chǎn)GABA的乳酸乳球菌，產(chǎn)量達到4.68 g/L;曾小群[12]等從新疆酸馬奶分離獲得一株戊糖乳桿菌，產(chǎn)GABA量為1.6 g/L;繆存影[13-14]等從酸菜中篩選獲得一株產(chǎn)酸菌，靜置發(fā)酵可得13.45 g/L的GABA。

本研究擬從陜西漢中泡菜汁中篩選能夠高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌，并對其進行生物特性的研究，以期為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)制備GABA以及功能性乳酸菌的篩選分離等相關(guān)研究提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

泡菜汁 來源于陜西漢中地區(qū)32家農(nóng)戶;GABA標準品 西安晶博生物科技有限公司;L-谷氨酸、次氯酸鈉、苯酚、四硼酸鈉、茚三酮、正丁醇、冰醋酸等 西安晶博生物科技有限公司。

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SPX-2501-G 型微電腦光照培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;SW-CJ-1CV超凈臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司; UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津;PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司;HC-3018型高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選和分離

1） 樣品菌株的活化：吸取1 mL泡菜汁樣品于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，在37℃條件下活化24 h。

2） 乳酸菌的分離純化及初步鑒定：吸取200 μL活化后的樣品溶液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)48 h。挑取生長狀況較好的單菌落，在MRS平板上不斷劃線進而得到純化菌株，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，記錄各菌落的形態(tài)特征，包括菌落的顏色、形狀、大小、表面和邊緣的性狀等。通過革蘭氏染色初步鑒定樣品菌株是否為乳酸菌并記錄菌株在顯微鏡下的形態(tài)，乳酸菌應為革蘭氏陽性菌。

3） 產(chǎn)酸菌株的篩選[15]：由于產(chǎn)酸量大的菌株可以水解培養(yǎng)基中添加的碳酸鈣，形成水解圈，因此可根據(jù)水解圈的大小來判斷菌株的產(chǎn)酸能力。篩取產(chǎn)酸能力較強的菌作為進一步篩選的菌株。

4） 產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選[16]：將產(chǎn)酸能力較強的純化菌株接種于5mL MRS液體培養(yǎng)基，在37℃條件下活化培養(yǎng)24h。再按2%的接種量將其接種于20mL以L-谷氨酸為基質(zhì)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫條件下靜置發(fā)酵3天，取發(fā)酵液經(jīng)紙層析定性分析及比色法定量測定后確定產(chǎn)GABA的菌株。

1.2.2? GABA的定性分析

采用紙層析法定性分析菌株發(fā)酵液中是否存在GABA，由此判斷菌株是否產(chǎn)GABA。按冰醋酸：水：正丁醇= 1：3：4的體積比配置展開劑，并添加0.4g/100mL的茚三酮作為顯色劑。取適量GABA及L -谷氨酸制成濃度均為1mg/mL的2mL標準液，取2mL樣品發(fā)酵液煮沸5 min，按照12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液以甲醇定容至2 mL。將定性濾紙裁剪成適當大小，用鉛筆在離濾紙底邊1.5 cm處畫一條直線，線上每隔1.5 cm標記一個點作為點樣位置。

用移液槍分別吸取2 μL標準液及樣品液依次點樣，將層析紙放入展開劑中層析2 h，之后放入57℃恒溫干燥箱中干燥顯色2-3 h。以GABA和谷氨酸標品及無菌MRS液體培養(yǎng)基發(fā)酵液作為對照，根據(jù)標準品的Rf值進行定性判斷，從而確定產(chǎn)GABA的菌株。

1.2.3? GABA的定量檢測

根據(jù)比色法定量測定產(chǎn)GABA菌株發(fā)酵液中的GABA含量。利用Berthelot反應，即苯酚、次氯酸鈉與游離氨的反應呈藍色來測定體系中的微量氨，通常GABA濃度越高，反應后溶液呈現(xiàn)的藍色越深。

1）GABA標準曲線的繪制：準確配制濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的GABA標準溶液，分別取1 mL標準液依次加入1 mL濃度為0.01 mol/L的四硼酸鈉緩沖液、1 mL濃度為6 g/100mL的苯酚溶液以及2.5 mL的7.5 g/100mL次氯酸鈉溶液，充分混勻后沸水浴10 min，再冰浴5min，待溶液呈藍綠色加入2 mL 60%乙醇溶液，630 nm處測OD值，以吸光度（y）為縱坐標，各標準液質(zhì)量濃度為橫坐標（x，mg/mL）作圖得標準曲線，并建立回歸方程。

2）樣品中GABA含量的測定：取5 mL產(chǎn)GABA菌株的發(fā)酵液于5000 r/min離心20 min，取1 mL上清液，按照前面的方法進行處理，630 nm處測OD值，取等量無菌水為空白對照，根據(jù)標準曲線方程求得相應GABA含量。

1.2.4 菌株生物特性研究

1）菌落菌體形態(tài)觀察

將產(chǎn)GABA的乳酸菌P16涂布于MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h后，觀察其菌落形態(tài)特征。挑取單個菌落于載玻片上進行涂片、革蘭氏染色，然后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

2）菌株生長曲線的測定

取對數(shù)生長期的菌株，按2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣一次，測定其菌液OD600nm值并繪制生長曲線。

3）菌株耐酸性的測定

以1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基的pH值，分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5和7.0，取對數(shù)生長期的P16菌株按2%的接種量接種，充分混勻，在37℃恒溫烘箱中培養(yǎng)20 h，使用分光光度計于600 nm波長下測定其OD值并繪制曲線。

4）菌株耐鹽性的測定

取對數(shù)生長期P16菌株以2%的接種量分別接種到NaCl （W/V）分別為0%、2%、4%、6%、7%、8%、9%的MRS液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，于37℃下培養(yǎng)20 h后測定OD600nm值。

5）菌株對膽鹽的耐受能力測定

取對數(shù)生長期的P16菌株，以2%的接種量分別接種于含有或不含0.3%膽鹽的MRS-THIO（ MRS含有0.2%的巰基乙酸鈉） 培養(yǎng)中，充分混合均勻，在37℃下培養(yǎng)。記錄培養(yǎng)基吸光值到達0.3個單位時各組所需的時間，不加膽鹽與加了膽鹽兩組的時間差即為P16在膽鹽中生長的延遲時間（ LT） ，延遲時間的長短，反映了乳酸菌對膽鹽的耐受能力。時間越短說明耐受膽鹽的能力越強，反之則耐受膽鹽的能力越弱。

1.2.5 菌株的分子生物學鑒定

提取產(chǎn)GABA的P16菌株的DNA進行16s rDNA基因的PCR擴增，用16S通用引物27f（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTT GTTACGACTT）對基因組進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物送至測序公司，測得的序列與數(shù)據(jù)庫進行對比分析，由此鑒定菌株的種類。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選結(jié)果

2.1.1 產(chǎn)酸菌株篩選結(jié)果

通過MRS培養(yǎng)基從32份泡菜汁樣品中共分離出約40株菌，80%的泡菜汁中只分離出一株菌株，由此可判斷泡菜汁中存在大量產(chǎn)酸菌株使得生長環(huán)境pH 值較低，不利于其他菌株的生長。將40株菌放入添加CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，依據(jù)培養(yǎng)基中碳酸鈣水解圈的大小判斷菌株產(chǎn)酸能力的強弱，由此得到14株產(chǎn)酸能力相對較強的菌株。

2.1.2 紙層析定性GABA結(jié)果

取GABA和L-谷氨酸標準溶液以及產(chǎn)酸樣品菌株的發(fā)酵液點樣，取無菌發(fā)酵液為空白對照，其中GABA標品編號為a，L-谷氨酸標品編號為b，無菌發(fā)酵液為c，14株樣品溶液編號為d～q。經(jīng)紙層析定性分析，結(jié)果如圖1所示。通過樣品發(fā)酵液及標準溶液的Rf值對比，可判斷標號為e的菌株P(guān)16產(chǎn)GABA較為明顯。

2.1.3 比色法定量測定GABA結(jié)果

1）GABA標準溶液曲線的繪制：由圖2可得，GABA標品溶液曲線的線性回歸方程為y=0.4521x-0.0229，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9912，精確度較高，因此可根據(jù)該方程計算樣品發(fā)酵液中GABA的含量。

2）樣品中GABA含量的測定：將菌株P(guān)16發(fā)酵液處理后于630 nm波長處

測得OD值為0.337，代入線性方程中，得出樣品發(fā)酵液中GABA含量為0.796 mg/mL。

2.2 菌株P(guān)16的生物特性研究

2.2.1 菌落菌體形態(tài)

將產(chǎn)酸菌株P(guān)16于MRS平板上通過劃線分離純化，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，菌株生長良好。其菌落形態(tài)如圖3A所示，菌落呈乳白色，不透明，形狀為較為規(guī)則的圓形，表面光滑，菌落直徑約為2 mm，邊緣齊整。菌體特征如圖3B所示，菌體桿狀，不產(chǎn)孢子，無運動性，革蘭氏陽性菌，顯微鏡下為短桿狀。

2.2.2 菌株P(guān)16的生長曲線

如圖4所示，菌株P(guān)16在2h時開始進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)10h后到達穩(wěn)定期，活菌數(shù)可達到108CFU/mL。

2.2.3 菌株P(guān)16的耐酸能力

pH值對菌株P(guān)16的影響見圖5。研究表明，該菌株生長最適pH范圍6.0-7.0，在pH=2.0時的酸性環(huán)境下仍可生長，由此可判斷該菌具有良好的耐酸性。

2.2.4 菌株P(guān)16對NaCl的耐受能力

NaCl對菌株P(guān)16的影響如圖6。研究表明，菌株P(guān)16對NaCl的耐受能力較好，在NaCl濃度達到9%時仍能生長，當氯化鈉濃度大于2% 時，短乳桿菌的生長能力大幅度下降。

2.2.5菌株P(guān)16的耐膽鹽能力分析

評價菌株是否能夠在腸道中生存與定殖的一個重要指標就是菌株對于膽鹽的耐受能力。表1中所示，本實驗中的菌株P(guān)16對于膽鹽的延遲時間為0.94 h，說明此菌株對膽鹽具有很好的耐受性。

2.3 菌株P(guān)16的分子生物學鑒定

根據(jù)blast結(jié)果，菌株P(guān)16與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）親源關(guān)系最近。依據(jù)形態(tài)特征及其遺傳特性16s rDNA對菌株P(guān)16初鑒定為Lactobacillus brevis，并將其命名為Lactobacillus brevisP16。

3 結(jié)論

本試驗從陜西漢中32份泡菜汁中分離篩選出一株可產(chǎn)GABA的乳酸菌P16，通過比色法測定其發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量為0.796 mg/mL。研究表明該菌株的生長周期較短，具有良好的耐酸和耐鹽性，耐受膽鹽的延遲時間可達0.94 h。通過菌落形態(tài)特征和16S rDNA序列分析鑒定為Lactobacillus brevis，將其命名為Lactobacillus brevisP16。該菌株具有良好的耐受性，產(chǎn)GABA能力較強，本研究可為高產(chǎn)GABA乳酸菌發(fā)酵劑的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。同時，影響乳酸菌產(chǎn)GABA的因素很多，本研究下一步將確定此菌株高產(chǎn)GABA的最佳工藝條件。

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[責任編輯 李帆]

[收稿日期]2021-07-10

[作者簡介]陳佩（ 1983—? ） ，女，陜西省涇陽縣人，博士，陜西開放大學中瑞旅游與酒店管理學院副教授。閆娟（ 1983— ） ，女，陜西省漢中市人，陜西開放大學中瑞旅游與酒店管理學院副教授。黨輝（1977— ），陜西省漢中市人，博士，陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院講師。

[基金項目]本文系陜西省第三批“青年杰出人才支持計劃”;陜西省科學技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2017NY-182）;陜西師范大學中央高校基本科研項目（GK201703069）;陜西開放大學2020年度科研一般課題（20DB06）研究成果之一。