參草通脈顆粒對(duì)慢性心衰大鼠Wnt信號(hào)通路配體表達(dá)的影響

劉曉蕾，張艷，禮海，王懿

（1.沈陽(yáng)市第二中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，遼寧 沈陽(yáng) 110101；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院專(zhuān)家門(mén)診，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

慢性心力衰竭（CHF）是以舒縮功能障礙為主的嚴(yán)重臨床綜合征，是多種疾病終末期表現(xiàn)。臨床治療多以常規(guī)西藥為主，重度及頑固性心衰采用心臟再同步治療、心臟移植等非藥物療法，但上述療法不良反應(yīng)多且價(jià)格昂貴、應(yīng)用受限。參草通脈顆粒是臨床治療CHF 的經(jīng)驗(yàn)方，王辰等[1]前期對(duì)280 例CHF 患者通過(guò)多中心隨機(jī)雙盲平行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)參草通脈顆粒對(duì)CHF 患者具有良好療效。本研究應(yīng)用ELISA 法（酶聯(lián)免疫法），通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt傳導(dǎo)通路，分析參草通脈顆粒治療CHF的療效機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體質(zhì)量為300～350 g，15 周齡，SPF 級(jí)SD雄性大鼠90只，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物制備 賴諾普利片（上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)：20131015，規(guī)格：10 mg）。參草通脈顆粒藥方組成：丹參、人參、黃芪、紅花、三七粉、益母草、茯苓、葶藶子（本溪三藥有限公司，批號(hào)：遼藥制Z0901013）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白測(cè)定的ELISA試劑盒，低溫高速離心機(jī)，酶標(biāo)儀等。

1.4 慢性心衰大鼠動(dòng)物模型制備 大鼠正常條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，為全部動(dòng)物編號(hào)后隨機(jī)抽取20只為正常組。其余大鼠禁食不禁水12 h后，腹腔麻醉，氣管插管，消毒后在左側(cè)第3、4肋間橫向切開(kāi)長(zhǎng)約1～2 cm，逐層分離，暴露視野可見(jiàn)心臟，用縫合線結(jié)扎距離左冠脈前降支起始點(diǎn)2～3 mm處，心電圖提示胸導(dǎo)ST段和T波出現(xiàn)明顯異常，說(shuō)明結(jié)扎成功，將心臟送回胸腔，用注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)制藥總廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H23021439）手術(shù)切口處敷用，大鼠生命體征平穩(wěn)后，撤掉呼吸機(jī)。預(yù)防術(shù)后感染，連續(xù)3 d應(yīng)用注射青霉素鈉30萬(wàn)IU，每天1次。正常飼養(yǎng)1周后，喂養(yǎng)飼料減少1/2；同時(shí)，大鼠每天1次力竭式游泳，連續(xù)4周。經(jīng)超聲檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≤60%，可判定為心力衰竭[2]。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 大鼠在造模前后共死亡11只，將剩余59只大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（n=19）、參草通脈顆粒組（n=20）、賴諾普利組（n=20），空白對(duì)照組為正常喂養(yǎng)未手術(shù)造模大鼠（正常組）。正常組和模型組大鼠不用藥，灌胃0.9%氯化鈉溶液10 mL/kg，每天1次。其余組大鼠用藥劑量，按人鼠劑量換算公式，藥品劑量（人口服）（g）×0.018/動(dòng)物體質(zhì)量（kg）＝劑量（g/kg）[3]，計(jì)算出賴諾普利組：1.5 mg生藥/kg/d，參草通脈顆粒組：9.2 g 生藥/kg/d，兩組藥溶于3 mL蒸餾水每天灌胃1次，各組連續(xù)給藥42 d。

1.6 實(shí)驗(yàn)取材 大鼠麻醉、處死，腹主動(dòng)脈取血，常規(guī)離心，收集上清液，分裝后低溫保存，用于檢測(cè)Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白濃度。

1.7 酶聯(lián)免疫法 按照試劑盒及儀器要求的操作步驟進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“”表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，參草通脈顆粒組和賴諾普利組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白水平明顯升高（P＜0.01）；與賴諾普利組比較，參草通脈顆粒組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11 蛋白水平明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比較(，μg/L)Table 1 The protein expression level of Wnt3a,Wnt5a and Wnt11 in the serumof rat in each group(,μg/L)

表1 各組大鼠血清Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平比較(，μg/L)Table 1 The protein expression level of Wnt3a,Wnt5a and Wnt11 in the serumof rat in each group(,μg/L)

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與賴諾普利組比較，cP＜0.01

檢測(cè)項(xiàng)目Wnt3a Wnt5a Wnt11參草通脈顆粒組（n=20）9.51±0.12bc 19.15±0.17bc 7.37±0.21bc正常組（n=20）15.28±0.69 32.18±1.02 12.58±0.63模型組（n=19）5.29±0.33a 10.97±0.64a 4.31±0.15a賴諾普利組（n=20）8.12±0.11b 16.36±0.71b 6.41±0.12b

3 討論

Wnt 信號(hào)通路在CHF 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括經(jīng)典Wnt 通路和非經(jīng)典Wnt 通路。Wnt 蛋白分為Wnt-1 族和Wnt-5a 族，Wnt3a 是Wnt 蛋白家族成員之一,是非常重要的Wnt 配體，與經(jīng)典通路有關(guān)，Wnt5a、Wnt11 配體是Wnt-5a族中的主要成員，與非經(jīng)典通路密切相關(guān)[4]。在慢性心衰過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a 與FZD 和LRP5/6 受體結(jié)合，并激活經(jīng)典的Wnt-Dvl-β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)心肌肥大效應(yīng)[5-6]。Wnt5a 和Wnt11 介導(dǎo)Wnt 非經(jīng)典信號(hào)通路，分別激活Wnt/PCP/JNK通路和Wnt/Ca2+信號(hào)通路，誘導(dǎo)心肌肥厚[7]。另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在心肌肥大小鼠模型中，經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路均被激活，Wnt3a和Wnt5a配體表達(dá)水平均上調(diào)[8]。因此，經(jīng)典Wnt通路和非經(jīng)典Wnt通路在CHF中起重要作用。

參草通脈顆粒是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐治療CHF的經(jīng)驗(yàn)方，療效確切，試驗(yàn)結(jié)果證明參草通脈顆?？擅黠@改善患者心功能分級(jí)，提高LVEF[1]。藥理學(xué)研究表明，黃芪可改善心肌舒縮功能、抑制纖維化[9]；人參可降低心肌膠原含量，減少心肌纖維化程度，延緩心室重構(gòu)[10-11]；紅花具有興奮心臟作用，增加冠狀動(dòng)脈血流量，改善心肌缺血[12]；丹參可抑制Ca2+內(nèi)流，阻止心肌肥厚信號(hào)傳導(dǎo)[13]；益母草對(duì)心肌肥厚具有一定的抑制作用[14]；三七可提高Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性,改善離子轉(zhuǎn)運(yùn),抑制心肌膠原增生[15]；葶藶子和茯苓均可利尿消腫[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平較正常組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），可能與機(jī)體對(duì)CHF的發(fā)生產(chǎn)生的負(fù)反饋現(xiàn)象有關(guān)，提示經(jīng)典Wnt通路和非經(jīng)典Wnt通路均可促進(jìn)CHF的病理機(jī)制的發(fā)生。經(jīng)藥物干預(yù)后，參草通脈顆粒組和賴諾普利組大鼠血清中Wnt3a、Wnt5a、Wnt11蛋白水平明顯升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，參草通脈顆粒組效果均優(yōu)于賴諾普利組。

綜上所述，參草通脈顆粒通過(guò)調(diào)控經(jīng)典Wnt通路和非經(jīng)典Wnt通路，治療慢性心衰療效顯著，值得臨床推廣應(yīng)用。