消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

★ 吳競(jìng) 陸運(yùn)鑫 唐友明 侯恩存 鄭景輝 唐偉智 謝俊宇（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南寧 53000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 南寧 5300）

目前，原發(fā)性支氣管肺癌（簡(jiǎn)稱(chēng)肺癌）在全球范圍仍然是發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，其總的5年生存率僅為17 %［1］。截止至2017年，我國(guó)的肺癌人數(shù)達(dá)80萬(wàn)例，死亡人數(shù)達(dá)70萬(wàn)例，占全球肺癌總?cè)藬?shù)的40 %［2］，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。其中，非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer）占所有肺癌類(lèi)型的85 %以上，肺癌的控制已成為全世界廣泛關(guān)注的問(wèn)題［3］。由于確診時(shí)絕大多數(shù)患者已處中晚期，化療是非小細(xì)胞肺癌最主要的治療手段，但隨著疾病進(jìn)展，常常出現(xiàn)耐藥情況。消積化瘀丸中藥方由黃芪、黨參、三七、山慈菇、菟絲子、蛇六谷、鱉甲、全蝎、蜈蚣、生牡蠣、守宮、土鱉蟲(chóng)、鹿角膠和炮山甲等14味藥組成，具有扶正清毒、化瘀消積之效。相關(guān)研究表明［4-6］，消積化瘀丸在惡性腫瘤的輔助治療中起到減毒增效、提高免疫功能、改善生存質(zhì)量等作用。

為揭示消積化瘀丸中藥方中的具體成分治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行探析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是結(jié)合了網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)和藥理學(xué)的一門(mén)新興學(xué)科［7］，可在分子層面通過(guò)對(duì)多個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和 多水平相互連接，來(lái)闡明藥物活性成分和靶點(diǎn)、靶點(diǎn)和疾病以及蛋白相互作用等多方面的關(guān)聯(lián)以及功能，從而得出多成分、多靶點(diǎn)、多通路的潛在作用機(jī)制［8-10］，為臨床工作提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 本研究涉及到的數(shù)據(jù)庫(kù)包括：中藥藥理學(xué)分析平臺(tái)系統(tǒng)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）；Drugbank（www.drugbank.ca/）；Batman（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；CTD（http://ctdbase.org/）；Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；KOBAS 3. 0 （http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）；uniprot（https://www.uniprot.org/）；STRING（https://string-db.org/）；Omicshare（http://www.omicshare.com/）；cytoscape3.6.1（http://www.cytoscape.org/）。

1.2 消積化瘀丸藥物活性成分收集與篩選 消積化瘀丸中藥方中包含植物類(lèi)和生物類(lèi)共14味藥，分別為黃芪、黨參、三七、山慈菇、菟絲子、蛇六谷、鱉甲、全蝎、蜈蚣、生牡蠣、守宮、土鱉蟲(chóng)、鹿角膠和炮山甲。通過(guò)中藥藥理學(xué)分析平臺(tái)系統(tǒng)（TCMSP），根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailablility，OB）數(shù)值越高，類(lèi)藥性（Drug likeness，DL）越好的原則［11-12］，設(shè)定 OB ≥ 30 %和DL≥0.18為限定條件進(jìn)行藥物活性成分篩選，再利用 Batman（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank（www.drugbank.ca/）進(jìn)一步完善藥物活性成分收集。最后將各數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的藥物活性成分進(jìn)行整合。

1.3 消積化瘀丸藥物活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到的藥物活性成分上傳至PharmMapper服務(wù)器平臺(tái)（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/），設(shè)定返回靶點(diǎn)數(shù)目并選擇藥效團(tuán)模型，呈交后由該服務(wù)器平臺(tái)反饋得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入uniprot進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換及校正，從而得出人源相關(guān)性的靶點(diǎn)。進(jìn)一步收集Batman數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中藥物成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，最后將各數(shù)據(jù)得到的靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重。

1.4 非小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)蛋白獲取 通過(guò)CTD（http://ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM（http://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)輸入相關(guān)檢索式檢索得到非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)靶蛋白，收集合并去重。

1.5 消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌的蛋白互作圖 將1.3和1.4中所得到的藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和疾病靶蛋白一起導(dǎo)入 Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）系統(tǒng)平臺(tái)，制作Venn交集圖并提取兩者交集靶點(diǎn)，進(jìn)而將交集靶點(diǎn)通過(guò)STRING（http://string-db.org/）在線(xiàn)平臺(tái)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），該軟件可對(duì)所有蛋白相互作用信息進(jìn)行評(píng)分，分值越高表明蛋白相互作用的可信度越高［13］。最后使用cytoscape3.6.1對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化處理和分析。

1.6 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路關(guān)系圖 作者將上述步驟中得到的藥物活性成分、交集靶點(diǎn)以及信號(hào)通路的信息共同導(dǎo)入cytoscape3.6.1（http://www.cytoscape.org/）軟件，以節(jié)點(diǎn)（node）表示成分、靶點(diǎn)和通路，邊（edge）表示兩者之間的相互作用，構(gòu)建并繪制出成分-靶點(diǎn)和靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.7 消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌的靶點(diǎn)GO分析和通路注釋 為揭示和闡明消積化瘀丸藥物活性成分治療非小細(xì)胞肺癌的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因功能和信號(hào)通路作用，可將1.5中的交集靶點(diǎn)蛋白通過(guò)生物學(xué)信息注釋庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/，DAVID）進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析，選擇生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（CC）和分子功能（MF）3個(gè)模塊繪制柱狀圖，然后采用KOBAS 3.0（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）制作KEGG信號(hào)通路圖并進(jìn)行通路注釋?zhuān)⒗肙micshare（http://www.omicshare.com/）制作高級(jí)氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 消積化瘀丸藥物活性成分收集與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果 通過(guò)中藥藥理學(xué)分析平臺(tái)系統(tǒng)（TCMSP），以O(shè)B≥30 %和DL≥0.18為限定條件，收集到植物來(lái)源活性成分共63個(gè)，其中黃芪20個(gè)，黨參21個(gè)，菟絲子11個(gè)，三七8個(gè)，山慈菇3個(gè)。通過(guò)Batman數(shù)據(jù)庫(kù)收集到動(dòng)物來(lái)源活性成分共28個(gè)，其中全蝎7個(gè)，蜈蚣7個(gè)，生牡蠣6個(gè)，鹿角膠2個(gè)，炮山甲2個(gè)，守宮2個(gè)，土鱉蟲(chóng)1個(gè)，鱉甲1個(gè)。另外，蛇六谷的活性成分因相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)資料不齊全，查找相關(guān)文獻(xiàn)得到蛇六谷成分1個(gè)，共計(jì)92個(gè)（表1）。下一步將TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出來(lái)的藥物活性成分提交由PhramMapper服務(wù)器平臺(tái)進(jìn)行預(yù)測(cè)靶點(diǎn)反饋，選取反饋評(píng)分（Fit）最高的前30位預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，與Batman、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)合并去重，最終篩選出消積化瘀丸具有潛在抗腫瘤作用的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)共計(jì)1 254個(gè)。

表1 消積化瘀丸藥物活性成分

（續(xù)表）

2.2 非小細(xì)胞肺癌靶蛋白收集結(jié)果 利用CTD數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Pubmed MESH獲取相關(guān)檢索式，如 Non-Small Cell Lung Cancer；NSCLC ；Carcinoma，Non-Small-Cell Lung ；Lung Neoplasms檢索得到非小細(xì)胞肺癌相關(guān)靶蛋白，最終篩選得到該疾病靶蛋白共計(jì)21 513個(gè)。

2.3 消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建和分析 將上述篩選的1 254個(gè)藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與21 513個(gè)疾病靶蛋白導(dǎo)入Draw Venn Diagram平臺(tái)，制作Venn交集圖，得到874個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)蛋白，即為消積化瘀丸對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有潛在治療作用的核心靶點(diǎn)（圖1）。

圖1 消積化瘀丸預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌靶蛋白的Venn交集圖

為進(jìn)一步說(shuō)明交集靶點(diǎn)蛋白之間的互作機(jī)制，通過(guò)STRING在線(xiàn)平臺(tái)，設(shè)定為人源相關(guān)性（Homo sapiens），制作蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），分析顯示消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，有866個(gè)節(jié)點(diǎn)（nodes），即有866個(gè)相互作用蛋白；有10 611條邊，即10 611條相互作用關(guān)系。進(jìn)而利用cytoscape 3.6.1軟件對(duì)該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)圖可視化處理，并使用NetworkAnalyzer插件進(jìn)行分析（圖2）。在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)的度（Degree）表示與節(jié)點(diǎn)相連的邊數(shù)，度值越大，邊數(shù)越多，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。結(jié)果顯示關(guān)鍵靶蛋白有AKT1、IL6、MYC、JUN、MAPK1等，其中度值最高（Degree=196）的靶蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）。

圖2 消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物活性成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路關(guān)系圖的構(gòu)建結(jié)果 為進(jìn)一步探究消積化瘀丸中不同藥物活性成分對(duì)非小細(xì)胞肺癌治療的作用機(jī)制，作者將藥物活性成分、核心靶點(diǎn)以及疾病靶蛋白放入cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理和分析（圖3、圖4）。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，選取度值（Degree）較高藥物活性成分節(jié)點(diǎn)（Node）進(jìn)行分析，連線(xiàn)（Edge）較多的節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中可能起到主要治療作用［14］。分析結(jié)果表明，Degree值排在前5位的藥物活性成分為adenine（腺嘌呤）、Stearic Acid（硬脂酸）、Tyrosin（酪氨酸）、leucine（亮氨酸）和Cholesterol（膽固醇）。

圖5 消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌作用靶點(diǎn)GO分析的條狀圖

圖4 核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路相互關(guān)系圖

2.5 消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果 為進(jìn)一步明確874個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)的潛在功能，作者使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析，選擇生物過(guò)程（BP）條目1 020個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目121個(gè)，分子功能（MF）條目246個(gè)，根據(jù)P<0.05原則提取各條目的排名前20位，分析結(jié)果顯示（圖5 A B C），在生物過(guò)程中，氧化還原過(guò)程、藥物反應(yīng)、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)以及細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控等排位靠前；在細(xì)胞組成中，主要包括細(xì)胞質(zhì)、胞液、質(zhì)膜和細(xì)胞外泌體等；在分子功能中，蛋白結(jié)合、三磷酸腺苷結(jié)合、同等蛋白結(jié)合以及蛋白質(zhì)同源二聚化活性等排在前面。通過(guò)KOBAS 3.0平臺(tái)進(jìn)行KEGG生物通路分析（圖6），再利用Omicshare繪制高級(jí)氣泡圖（圖7），設(shè)定P<0.05選取前20條通路，氣泡從綠色到紅色表示P由大到小，氣泡面積大小反應(yīng)基因數(shù)量的多少。結(jié)果顯示消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制主要涉及 Carbohydrate digestion and absorption 信號(hào)通路、Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption信號(hào)通路、Fatty acid degradation信號(hào)通路、Salivary secretion 信號(hào)通路和 Pancreatic secretion 信號(hào)通路等。

圖3 消積化瘀丸藥物活性成分-核心靶點(diǎn)相互關(guān)系圖

圖6 Carbohydrate digestion and absorption信號(hào)通路

圖7 消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌作用靶點(diǎn)KEGG通路富集的氣泡圖

3 討論

肺癌在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中早有記載，當(dāng)屬“咳嗽”“肺積”“咯血”等范疇，其病理基礎(chǔ)為正氣不足，氣血陰陽(yáng)失調(diào)，以及臟腑功能紊亂，與痰、瘀、毒、虛相關(guān)，人體防衛(wèi)功能下降，邪氣趁虛而犯引起［15］。其證型多種多樣，而尤以本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜多見(jiàn)。賈英杰［16］認(rèn)為肺癌發(fā)病毒瘀互結(jié)是主要原因，加之三焦氣機(jī)升降失調(diào)，日久成積，其中“毒”“瘀”始終存在于整個(gè)疾病過(guò)程。周計(jì)春等［17］也提出了癌邪之毒是肺癌產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移之根本原因的觀(guān)點(diǎn)，并與痰、瘀、熱等密切相關(guān)。

根據(jù)此次研究結(jié)果，cytoscape分析提示消積化瘀丸方中的主要藥物活性成分包括adenine（腺嘌呤）、Stearic Acid（硬脂酸）、Tyrosin（酪氨酸）、leucine（亮氨酸）和Cholesterol（膽固醇）等，其中度值最高為adenine（腺嘌呤）。劉飛飛等［18］研究表明，腺嘌呤與順鉑聯(lián)用時(shí)，可明顯增加細(xì)胞凋亡速率。另外，李慧敏等［19］細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，硬脂酸可能是通過(guò)抑制自身磷酸化的方式誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。這也證實(shí)了消積化瘀丸的藥物活性成分具有增效減毒之功。PPICN分析顯示，關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有AKT1、IL6、MYC、JUN和MAPK1等。AKT-1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1）作為一種癌基因，其表達(dá)水平越高，癌細(xì)胞分化程度越低，惡性程度越高。IL6（白細(xì)胞介素6）是介導(dǎo)炎癥產(chǎn)生的重要因素，與腫瘤之間需建立一種反饋信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)［20］。朱星宇［21］研究顯示，在NSCLC患者血清中IL6水平顯著高于正常人。KEGG生物信號(hào)通路分析可知，Carbohydrate digestion and absorption（糖類(lèi)消化與吸收信號(hào)通路 ）、Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption（內(nèi)分泌等因素調(diào)節(jié)鈣離子重吸收信號(hào)通路）以及 Fatty acid degradation（脂肪酸降解信號(hào)通路）等為消積化瘀丸作用于非小細(xì)胞肺癌的主要生物途徑。已有研究證明，糖代謝異常是促進(jìn)腫瘤微環(huán)境形成最為關(guān)鍵的一環(huán)［22］，與正常細(xì)胞有氧氧化提供能量不同，腫瘤微環(huán)境常處于缺氧狀態(tài)，缺氧會(huì)使腫瘤細(xì)胞進(jìn)行無(wú)氧糖酵解，即“Warburg效應(yīng)”，該效應(yīng)廣泛存在于包括肺癌等多種惡性腫瘤中，與其生物學(xué)行為密切相關(guān)，如增殖轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、抗凋亡等［23-24］，而大量的糖酵解又給腫瘤細(xì)胞的繁殖提供了充足的能量，使其不斷生長(zhǎng)。本次研究發(fā)現(xiàn)主要活性成分腺嘌呤在糖類(lèi)消化與吸收信號(hào)通路中作用于為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶靶點(diǎn)，也證實(shí)了上述研究者的觀(guān)點(diǎn)。

綜上所述，消積化瘀丸治療非小細(xì)胞肺癌消積化瘀丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝、抗炎等方面抑制腫瘤細(xì)胞增殖及增加細(xì)胞凋亡速率，多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗腫瘤作用。中藥多種藥物活性成分在靶點(diǎn)上的協(xié)同效應(yīng)，使其表現(xiàn)出多途徑、多功能的治療特點(diǎn)，此外，藥效疊加以及毒性分散也是中醫(yī)藥治療腫瘤的特色之一［25］。這些特點(diǎn)使中藥更具優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也對(duì)中藥的化學(xué)成分、作用機(jī)制提出了更多疑難問(wèn)題［26］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中藥結(jié)合則是中醫(yī)藥未來(lái)發(fā)展的一大趨勢(shì)，本研究中一些藥物活性成分的收集篩選尚有不足，以及網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)等不可控因素，研究結(jié)果尚需進(jìn)一步探討。