西洋參組織培養(yǎng)研究近況及其技術(shù)相關(guān)問(wèn)題的探討

路俊仙，郭瑞齊，林慧彬

（山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014）

西洋參為五加科植物西洋參（Panax quinquefolium L.）的干燥根，原產(chǎn)于加拿大和美國(guó)，我國(guó)始載于清朝汪昂《補(bǔ)圖本草備要》。西洋參能養(yǎng)陰潤(rùn)肺，清心安神，有人參的補(bǔ)性而無(wú)人參的燥性［1］，是藥食兩用的名貴補(bǔ)品。市場(chǎng)需求量一直較大，但價(jià)格始終居高不下。其原因在于：西洋參種植周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低［2］；生產(chǎn)中依靠種子繁育種苗卻受限于種子產(chǎn)量低及其嚴(yán)重的后熟現(xiàn)象［3］，造成栽培用實(shí)生苗供應(yīng)不足，限制其種植面積的擴(kuò)增，進(jìn)而制約西洋參總產(chǎn)的提高。

組織培養(yǎng)技術(shù)通過(guò)植物離體細(xì)胞、組織、器官等在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織或者進(jìn)一步分化長(zhǎng)成新植株，不受環(huán)境、氣候、病蟲(chóng)害影響，可實(shí)現(xiàn)全年穩(wěn)定生產(chǎn)，還可通過(guò)優(yōu)良品種篩選、細(xì)胞株篩選、冠癭組織培養(yǎng)加快目標(biāo)產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化、提高得率［4，5］。目前西洋參組織培養(yǎng)研究多集中于利用冠癭組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物及外植體誘導(dǎo)愈傷組織，大規(guī)模生物發(fā)生器擴(kuò)大研究較少，西洋參成功分化再生植株和育種的研究也很少。一方面急需建立西洋參細(xì)胞、冠癭組織和毛狀根的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)體系，提取西洋參藥效成分；另一方面需建立成熟穩(wěn)定的西洋參快繁體系，大規(guī)?？焖俜敝澄餮髤⒎N苗并培育新品種，擺脫自然環(huán)境條件的限制，滿足栽培需求，解決西洋參供求矛盾，提高西洋參產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本文就西洋參組織培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域、技術(shù)方法、存在問(wèn)題及解決措施進(jìn)行歸納總結(jié)，為西洋參組培技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化提供研究依據(jù)和思路。

1 組織培養(yǎng)在西洋參研究中的適用性

1.1 無(wú)毒種苗的快速生產(chǎn)

西洋參生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，種植4～5年后才能結(jié)種，致使種子稀缺且價(jià)格高昂，約 1 000美元/kg［6］。種子需經(jīng)形態(tài)后熟和生理后熟方能發(fā)育完全，休眠期達(dá)200天左右，極大限制了栽培用實(shí)生苗的供應(yīng)量，繼而限制西洋參的種植規(guī)模和市場(chǎng)供應(yīng)。采用組織培養(yǎng)進(jìn)行離體快繁，能夠避開(kāi)西洋參植株結(jié)種和種子休眠期的限制，能在短期內(nèi)提供大量栽培用實(shí)生苗，滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求，同時(shí)縮短西洋參的種植周期，加快市場(chǎng)供應(yīng)。目前組織快繁西洋參雖已開(kāi)展較多研究，但多限于愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)，有關(guān)西洋參分化培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件還需進(jìn)一步優(yōu)化，至今仍未建立穩(wěn)定可行的完整技術(shù)體系，急需對(duì)此加強(qiáng)研究。

1.2 優(yōu)良品種的培育

自20世紀(jì)80年代至今，我國(guó)引種西洋參已有40余年。迫于栽培初期種苗缺乏、有苗就栽的窘境及參類植物種間雜交具有親和性，西洋參種質(zhì)混雜現(xiàn)象日益嚴(yán)重，至今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)西洋參栽培優(yōu)良品種，現(xiàn)有西洋參普遍存在種質(zhì)退化、抗性和產(chǎn)量下降問(wèn)題，嚴(yán)重影響西洋參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，急需選育抗病性強(qiáng)、產(chǎn)量高、生長(zhǎng)健壯的優(yōu)良品系［7］。育種工作的基礎(chǔ)是種質(zhì)資源，西洋參種質(zhì)收集保存的數(shù)量和質(zhì)量直接決定了育種的成功與否。為此應(yīng)構(gòu)建西洋參核心種質(zhì)，整合多學(xué)科、多技術(shù)開(kāi)展多元化優(yōu)良品種選育。西洋參組培技術(shù)能夠有效保存植物種質(zhì)，借助基因工程等生物學(xué)技術(shù)改良品質(zhì)并繁育優(yōu)良品種［8，9］，從而提高西洋參的品質(zhì)和產(chǎn)量，推動(dòng)西洋參產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量、快速發(fā)展，滿足人們的健康需求。

1.3 次生代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化

次生代謝產(chǎn)物多數(shù)是藥用植物的有效成分，具有重要的藥理作用和生理活性［10］，如西洋參中含有人參皂苷Rb1、Re、Rg1等多種皂苷類成分及多糖、氨基酸等，是其改善心血管［11，12］、抗Ⅱ型糖尿病［13］、抗癌［14］、提高免疫力［15］、抗氧化［16］等多種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)際上西洋參中這些化學(xué)成分的含量較低，構(gòu)建有效成分的快速合成體系提高產(chǎn)量并開(kāi)展大規(guī)模的提取研究意義重大。采用組培結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得不同基因型的冠癭組織或者毛狀根，并通過(guò)不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件，可加速細(xì)胞繁殖，定向高效誘導(dǎo)西洋參次生代謝產(chǎn)物。此外西洋參冠癭組織或毛狀根培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌污染率較低，更利于大規(guī)模工廠化培養(yǎng)和生產(chǎn)特定成分。研究表明，采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，較固體培養(yǎng)基培養(yǎng)其生長(zhǎng)速率可提高80%，且無(wú)需加入外源激素，所得次生代謝物含量高、遺傳性狀穩(wěn)定。這也是未來(lái)西洋參有效成分快速獲得的有效途徑。

2 西洋參組織培養(yǎng)的技術(shù)方法

2.1 外植體的選擇和處理

外植體是決定組培成功與否的首要因素。外植體的選擇因素包括取材部位和取材時(shí)間。盡量選取溫室或人工氣候條件下培養(yǎng)的健壯無(wú)病蟲(chóng)害優(yōu)良植株，其生長(zhǎng)旺盛、狀態(tài)良好的器官、組織和細(xì)胞更是獲得高活力外植體的前提，這對(duì)原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織的形成及植株再生有重要影響。西洋參外植體取材部位較多，花藥、花蕾、葉片、葉柄、子葉、胚軸、根、莖段、根髓、胚等材料均可，其中種胚、子葉、芽苞、葉柄、根的愈傷組織誘導(dǎo)率在69% ～98%，是較好的外植體［17，18］。此外誘導(dǎo)率也受外植體器官本身所處的生理狀態(tài)、發(fā)育時(shí)期及其細(xì)胞所處的分裂期的影響［19］。不同生長(zhǎng)時(shí)期外植體愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著，取材時(shí)間春季為宜，植物體生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞活力強(qiáng)，獲得的外植體愈傷組織污染率最低、誘導(dǎo)率最高。劉本葉等［18］研究表明，5月底前后葉片外植體誘導(dǎo)率在95%以上，到6月底取材，誘導(dǎo)率降至30%左右。

2.2 培養(yǎng)基的選擇

公認(rèn)MS培養(yǎng)基最適于西洋參組織培養(yǎng)，采用1/2 MS、White培養(yǎng)基的研究偶見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)培養(yǎng)階段、培養(yǎng)目的又將培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基主要以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)添加不同種類、不同比例的生長(zhǎng)激素、礦物質(zhì)、蔗糖等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配制而成。目前西洋參愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)技術(shù)日臻完善和成熟，已為后續(xù)培養(yǎng)工作的順利開(kāi)展奠定扎實(shí)基礎(chǔ)。西洋參愈傷組織誘導(dǎo)研究始于1974年［20］，20世紀(jì)90年代起至今相關(guān)研究［21-28］報(bào)道大量出現(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 西洋參組織培養(yǎng)條件和培養(yǎng)結(jié)果

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的優(yōu)化

生長(zhǎng)激素、礦物質(zhì)和蔗糖等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物生長(zhǎng)、分化、再生及代謝產(chǎn)物的形成具有特殊的調(diào)節(jié)作用，在整個(gè)組培過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。西洋參組培常用的生長(zhǎng)激素包括2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）［26-28］、吲哚-3-乙酸（IAA）［26］、萘乙酸（NAA）［22，24］、6-芐氨基嘌呤（6-BA）［22，23］、吲哚丁酸（IBA）［21，23］等。其中2，4-D是誘導(dǎo)離體培養(yǎng)西洋參胚狀體發(fā)生的必需因子，直接影響愈傷組織形成及胚狀體發(fā)生。高濃度2，4-D促進(jìn)愈傷組織發(fā)生，誘導(dǎo)率可達(dá)100%，但抑制各種材料的胚狀體發(fā)生，尤其對(duì)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的無(wú)菌幼苗的抑制效果明顯；相反低濃度的2，4-D均能誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。生長(zhǎng)素IAA、NAA都有助于側(cè)根的發(fā)生及生長(zhǎng)，誘導(dǎo)能力IAA ＞NAA［26］。礦物質(zhì)元素同樣能夠促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。范代娣等［21］測(cè)得，MS培養(yǎng)基添加MgSO4含量為92.5 mg/L時(shí)，能有效促進(jìn)嫩莖愈傷組織生長(zhǎng)，而MgSO4含量為370 mg/L時(shí)，根的愈傷組織生長(zhǎng)速度最快。另外添加蔗糖作為碳源或者合適濃度有機(jī)物也對(duì)西洋參組培有明顯的促進(jìn)作用［17，27］。

西洋參組培過(guò)程中除了受到外植體、培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的成分和配比等因素的影響外，光照、濕度、溫度等多種條件也會(huì)對(duì)西洋參組培產(chǎn)生影響。光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對(duì)西洋參愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)有顯著影響；光照培養(yǎng)對(duì)西洋參胚狀體的發(fā)生有一定的促進(jìn)作用。西洋參組培的溫度一般在25℃左右為宜。

3 西洋參組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題

西洋參組織培養(yǎng)除了普遍存在遺傳穩(wěn)定性、玻璃化、褐變及污染等常見(jiàn)問(wèn)題外，還面臨一些其它問(wèn)題。

3.1 西洋參組織培養(yǎng)多停留在愈傷組織誘導(dǎo)及利用冠癭組織獲取次生代謝產(chǎn)物層面

西洋參組織培養(yǎng)大量研究始于20世紀(jì)90年代，已有較長(zhǎng)的研究歷史，但是進(jìn)展相對(duì)緩慢。目前愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)成熟，培養(yǎng)冠癭組織進(jìn)行西洋參次生代謝化合物的合成研究較多，而真正進(jìn)行植物再生和快繁的研究寥寥無(wú)幾，西洋參離體組織培養(yǎng)獲得再生植株的研究未見(jiàn)報(bào)道。分析認(rèn)為西洋參組培過(guò)程中人參皂苷可以通過(guò)細(xì)胞分泌進(jìn)入到周圍環(huán)境中，大部分皂苷類成分對(duì)組培西洋參的生長(zhǎng)都具有低濃度促進(jìn)和高濃度抑制作用［29］。愈傷組織后期的繼代培養(yǎng)基及組織分化和生根培養(yǎng)基中，皂苷類成分日益增多，對(duì)西洋參生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)，造成后續(xù)工作開(kāi)展困難。希望研究者可以突破這個(gè)問(wèn)題，推動(dòng)組培技術(shù)在西洋參快繁、育種中的應(yīng)用，解決西洋參產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的瓶頸問(wèn)題。

3.2 西洋參組培生根難的問(wèn)題

鑒于西洋參植物本身的生長(zhǎng)惰性，利用外植體進(jìn)行植株再生過(guò)程中發(fā)根尤其困難。隨著胚狀體誘導(dǎo)再生植株技術(shù)的出現(xiàn)，這一問(wèn)題有望解決。研究表明，胚狀體遺傳相對(duì)穩(wěn)定，再生的植株變異較少。更重要的是體細(xì)胞胚具有胚根胚芽?jī)蓸O性，這一特點(diǎn)克服了組培過(guò)程中生根培養(yǎng)困難的問(wèn)題；而且胚狀體存在生理隔離，其胚性細(xì)胞在發(fā)育早期就與其周圍的其它細(xì)胞形成明顯界限，隨著發(fā)育的進(jìn)程，最后易與周圍組織分離。繞開(kāi)外植體取自西洋參造成的誘導(dǎo)困難、增殖緩慢的瓶頸，另辟蹊徑快速誘導(dǎo)出不定芽，最終成功獲得再生植株。

3.3 西洋參的品種混雜問(wèn)題

目前栽培西洋參種質(zhì)混雜，缺少優(yōu)勢(shì)品種，降低了西洋參的產(chǎn)量和質(zhì)量。如何采用組織培養(yǎng)技術(shù)加快育種進(jìn)程、改良品種，對(duì)西洋參產(chǎn)業(yè)發(fā)展和資源保護(hù)意義重大。而體細(xì)胞胚具有單細(xì)胞起源的特點(diǎn)，愈傷組織密度高、遺傳穩(wěn)定，是理想的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，更易開(kāi)展離體篩選、外源基因?qū)牒腕w細(xì)胞雜交等新技術(shù)育種。另外體細(xì)胞胚適合低溫保存，解凍后仍可再生且遺傳性狀穩(wěn)定，為新技術(shù)育種提供了時(shí)間和空間上的便利。

4 展望

近年來(lái)西洋參組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，培養(yǎng)條件不斷優(yōu)化，體外次生代謝物生產(chǎn)已取得顯著進(jìn)步。但仍存在一些問(wèn)題需克服，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)西洋參產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。一方面大規(guī)模的西洋參生產(chǎn)仍存在困難，將實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)是今后努力的方向，繼續(xù)優(yōu)化體外培養(yǎng)方法和技術(shù)，特別是克服各種培養(yǎng)基中皂苷類成分對(duì)西洋參生長(zhǎng)抑制的瓶頸，促進(jìn)西洋參大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)；另一方面組培過(guò)程中西洋參愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)形成耗時(shí)耗力，且生根困難，需綜合西洋參研究結(jié)果，解析阻礙西洋參組培技術(shù)進(jìn)步的因素，有的放矢、有效縮短培養(yǎng)時(shí)間，推動(dòng)西洋參快繁、育種的進(jìn)步，有效保存、不斷豐富西洋參種質(zhì)，促進(jìn)西洋參產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。