牛糞高溫堆制過(guò)程中細(xì)菌和真菌多樣性變化分析

岳壽松，張玉鳳，邊斐，張燕，陳高，朱友峰，王翠萍

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，山東 濟(jì)南 250100）

畜禽糞便是規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的主要廢棄物，處理不當(dāng)會(huì)成為重要的環(huán)境污染源。高溫堆制是糞便無(wú)害化轉(zhuǎn)化的重要途徑［1-3］。堆肥腐熟主要是由微生物參與的生理生化過(guò)程，在微生物驅(qū)動(dòng)下，完成畜禽糞便有機(jī)質(zhì)的生物降解和轉(zhuǎn)化［4］。相對(duì)于自然發(fā)酵，通過(guò)添加篩選的功能菌可以改善堆肥中原始微生物種群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)木質(zhì)纖維素降解，顯著加快堆肥腐熟進(jìn)程，縮短發(fā)酵周期并提高降解效率［5，6］。

微生物多樣性變化是糞便高溫堆制不同階段的重要特征。研究堆肥過(guò)程中微生物群落代謝特征，對(duì)揭示有機(jī)物降解機(jī)制及堆肥條件的優(yōu)化具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值。王秀紅等［7］利用宏基因組技術(shù)研究了好氧堆肥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌群的種類和豐度存在多樣性。方華舟等［8］利用平板培養(yǎng)法研究牛糞好氧堆肥期間微生物特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌是發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物，中溫性細(xì)菌是升溫階段主要作用菌群，嗜熱放線菌及嗜熱細(xì)菌是高溫階段優(yōu)勢(shì)菌群，霉菌是降溫階段優(yōu)勢(shì)菌群。王亮［9］研究表明，牛糞自然好氧發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌類是優(yōu)勢(shì)菌群，多樣性指數(shù)大于2.1；真菌類微生物在降溫期持續(xù)增加，是中后期的優(yōu)勢(shì)群體，對(duì)纖維素分解起決定性作用。

已有研究大都利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，或利用DGGE及高通量測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)細(xì)菌或真菌進(jìn)行分析，對(duì)高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌和真菌群落聯(lián)合分析、系統(tǒng)研究報(bào)道較少。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，分析牛糞高溫堆肥過(guò)程中不同階段物料中細(xì)菌和真菌種類與相對(duì)豐度變化及演替特點(diǎn)，對(duì)于理解牛糞堆肥過(guò)程、提高堆肥效果、開(kāi)發(fā)新型堆肥菌劑均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

堆肥材料：新鮮牛糞、玉米秸稈粉和糠醛渣。微生物發(fā)酵菌由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心研制，主要成分為枯草芽孢桿菌和米曲霉孢子混合物，活菌和孢子含量100億/克。添加量為每噸物料500克。試驗(yàn)材料基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。發(fā)酵物料碳氮比（C/N）調(diào)整為30∶1，初期含水量為60%，pH值7.2。

表1 堆肥材料的基本理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)方法

采用槽式發(fā)酵工藝。玉米秸稈粉碎長(zhǎng)度小于2 cm，糞便與粉碎好的輔料混合，調(diào)節(jié)水分至60%，加入微生物接種劑，充分?jǐn)嚢杌靹?，送至發(fā)酵槽中。堆成高1.2 m、寬2 m、長(zhǎng)3 m的條垛，3次重復(fù)。

每天上午9∶30—10∶30測(cè)定條垛表層下30 cm溫度，同時(shí)記錄周圍環(huán)境溫度。物料溫度高于60℃進(jìn)入高溫期，每2天翻堆，維持溫度70℃左右；物料溫度下降到50℃以下，停止翻堆，進(jìn)入降溫期；物料溫度降到略高于環(huán)境溫度為熟化期。分別于升溫期（IM，物料入發(fā)酵池1～3 d）、高溫期（TH）、降溫期（CO）、熟化期（MA）進(jìn)行取樣。取樣方法：于每個(gè)條垛表層下30 cm取5個(gè)點(diǎn)，混合均勻；3個(gè)重復(fù)的樣品再次混合均勻，立即置于-18℃冰柜保存。

1.3 DNA提取與測(cè)序

采用深圳華大基因科技有限公司Illumina平臺(tái)Hiseq進(jìn)行16S rRNA和ITS測(cè)序（pairedend）。提取樣品基因組DNA，對(duì)檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫(kù)。設(shè)計(jì)合成含有測(cè)序接頭的雙index融合引物，以基因組DNA為模板，進(jìn)行融合引物PCR，磁珠篩選目的amplicon片段，用合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備和測(cè)序。用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的生物信息分析。下機(jī)數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的clean data用于后期分析；通過(guò)reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成tags；拼接的tags經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，在97%相似度下用QIIME軟件將其聚類為用于物種分類的OTU（operational taxonomic units），利用QIIME軟件計(jì)算樣品Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、phylogenetic diversity（譜系多樣性）的alpha多樣性值，經(jīng)過(guò)UniFrac算法利用系統(tǒng)進(jìn)化信息比較樣品間物種群落差異［10，11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種分類和相對(duì)豐度分析

2.1.1 OTU數(shù)及相對(duì)豐度分析 OTU代表樣品物種豐富程度。細(xì)菌16S rRNA測(cè)序結(jié)果（表2）顯示，升溫期（IM）、高溫期（TH）、降溫期（CO）和熟化期（MA）樣本共產(chǎn)生965個(gè)OTU。CO期和MA期細(xì)菌物種豐富度比IM期和TH期高80%以上，說(shuō)明物料經(jīng)高溫轉(zhuǎn)化后，更有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。

真菌ITS測(cè)序結(jié)果（表2）顯示，IM、TH、CO和MA期樣本共產(chǎn)生164個(gè)OTU。TH期比IM期的OTU數(shù)增加了29.2%，MA期比CO期增加31.1%。說(shuō)明高溫伴隨真菌相對(duì)豐度的增加，而在熟化期真菌物種相對(duì)豐度又有較大幅度增加，與細(xì)菌表現(xiàn)明顯不同。

表2 不同發(fā)酵時(shí)期樣品OTU數(shù)

2.1.2 Core-Pan OTU分析 利用Core-Pan OTU分析，統(tǒng)計(jì)樣品間或組間共有和特有OTU數(shù)目。16S rRNA各時(shí)期共有的OTU個(gè)數(shù)為290，占樣品總OTU數(shù)的30.1%；IM 期特有的OTU 31個(gè)、TH 期9個(gè)、CO期58個(gè)、MA期42個(gè)（圖1A）。ITS各時(shí)期共有的OTU個(gè)數(shù)為21個(gè)，占樣品總數(shù)的12.8%。IM期特有的OTU 11個(gè)、TH期28個(gè)、CO期7個(gè)、MA期26個(gè)（圖1B）。上述結(jié)果表明，細(xì)菌與真菌的多樣性和演替模式不同，細(xì)菌共有的OTU占總數(shù)量的比例較高，特有的OTU相對(duì)較少，說(shuō)明細(xì)菌種群相對(duì)穩(wěn)定；真菌共有的OTU占總數(shù)量的比例較低，各時(shí)期特有的OTU個(gè)數(shù)相對(duì)較多，說(shuō)明伴隨物料高溫堆制進(jìn)程，真菌種群演替更劇烈。

圖1 不同時(shí)期的Core-Pan OTU圖

2.1.3 微生物種群多樣性差異 Chao1指數(shù)越大說(shuō)明物種總數(shù)越多，Shannon指數(shù)越大說(shuō)明物種多樣性越高，Simpson指數(shù)越大物種多樣性越低。16S rRNA測(cè)序結(jié)果（表3）表明，CO期和MA期的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)比IM期和TH期高，Simpson指數(shù)較低，表明物料經(jīng)過(guò)高溫發(fā)酵，細(xì)菌的物種數(shù)量增加，且種類更豐富。

表3 不同發(fā)酵時(shí)期樣品16S rRNA和ITS種群多樣性

ITS測(cè)序結(jié)果（表3）表明，TH 期、MA期Chao1指數(shù)比IM期和CO期高，表明高溫期和熟化期真菌的物種數(shù)量增加。TH期和MA期Shannon指數(shù)也增加，說(shuō)明高溫期和熟化期具有更高的真菌物種多樣性。真菌種群數(shù)量的增加是物料溫度升高的重要影響因子，熟化期間豐富的養(yǎng)分可能更有利于真菌生長(zhǎng)，從而增加了真菌的相對(duì)豐度。

2.2 物種注釋及其相對(duì)豐度分析

2.2.1 門水平群落組成分析 IM期、TH期細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門（相對(duì)豐度大于1%）均有4種，各菌門的相對(duì)豐度不同；CO期和MA期細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門明顯增多，分別為9種和8種，說(shuō)明降溫期和熟化期細(xì)菌多樣性增加。與IM期相比，TH期、CO期和MA期Actinobacteria（放線菌門）相對(duì)豐度大幅度提高，分別提高14.8、7.4、22.8個(gè)百分點(diǎn)；Bacteroidetes（擬桿菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）相對(duì)豐度明顯降低，Bacteroidetes相對(duì)豐度分別降低13.8、20.5、20.6個(gè)百分點(diǎn)，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度分別降低8.7、10.0、12.0個(gè)百分點(diǎn)（表4）。放線菌在堆肥高溫期是分解木質(zhì)素、纖維素的優(yōu)勢(shì)菌群［12］。擬桿菌屬是糞便中的主要微生物，其相對(duì)豐度降低，說(shuō)明糞便經(jīng)高溫發(fā)酵轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)，與其生境轉(zhuǎn)化有關(guān)。

表4 細(xì)菌門水平優(yōu)勢(shì)菌群

真菌ITS測(cè)序結(jié)果（表5）表明，TH期、CO期和MA期的Ascomycota（子囊菌門）相對(duì)豐度均比IM大幅度增加，分別增加30.8、71.6、61.7個(gè)百分點(diǎn)。TH期的Zygomycota（接合菌門）和Basidiomycota（擔(dān)子菌門）相對(duì)豐度比IM亦有大幅度增加，分別增加33.4、9.4個(gè)百分點(diǎn)。Ascomycota、Basidiomycota在自然界中與動(dòng)植物殘?bào)w如木材、食品、皮革等腐解有關(guān)，Zygomycota可以產(chǎn)生豐富的酶和代謝產(chǎn)物［13-15］。高溫期子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度大幅度提高對(duì)物料快速腐解具有重要作用。

表5 真菌門水平優(yōu)勢(shì)菌群

2.2.2 屬水平群落組成分析 各時(shí)期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群（相對(duì)豐度大于1%）數(shù)量不同，IM 期和CO期均有14個(gè)屬，MA期13個(gè)屬，TH期10個(gè)屬（表6），各時(shí)期優(yōu)勢(shì)菌群種類差異很大。IM期的有害致病菌包括Pedobacter（土地桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）等，其相對(duì)豐度很高，可能是未腐熟的糞便中自然存在的。TH期、CO期和MA期上述菌群大幅度下降或消失，說(shuō)明高溫過(guò)程實(shí)現(xiàn)了物料無(wú)害化。TH期與IM 期比較，Sphingobacterium（鞘氨醇桿菌屬）、Pseudoxanthomonas（假黃色單胞菌屬）、Thermovum（嗜熱菌屬）和Bacillus（芽孢桿菌屬）相對(duì)豐度大幅度提高，表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)熱和物質(zhì)轉(zhuǎn)化特點(diǎn)。與IM期比較，CO期和MA期優(yōu)勢(shì)菌群除Pseudoxanthomonas大幅度升高外，還有高豐度的Actinomadura（放線菌屬）和Streptomyces（鏈霉菌屬），均為生境中重要的微生物，能產(chǎn)生酶、維生素和有機(jī)酸等，可促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化和增加土壤養(yǎng)分［12、16］。

與IM期相比，TH期真菌屬的優(yōu)勢(shì)菌明顯增多，其次是MA期（表7）。TH期和MA期優(yōu)勢(shì)菌群包含產(chǎn)生高溫和物質(zhì)轉(zhuǎn)化功能的菌，如引起多種物質(zhì)降解和霉腐功能的Aspergillus（曲霉屬），具有降解纖維素和生防功能的Chaetomium（毛殼屬），能產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶的Humicol a（腐質(zhì)霉屬），糞便常分離到的具有腐生功能的Ascobolus（糞盤菌屬），具有漆酶分泌功能的Coprinopsis（鬼傘屬）等，在牛糞和秸稈高溫腐熟過(guò)程中均具有重要作用［17-19］。

2.3 菌群結(jié)構(gòu)的聚類（熱圖）分析

2.3.1 門水平聚類分析 利用熱圖對(duì)不同時(shí)期物料細(xì)菌和真菌群落組成進(jìn)行相似性和差異性分析。細(xì)菌門水平物種熱圖（圖2A）表明，IM 期和TH期物種組成和相對(duì)豐度最相似，CO期和MA期物種組成和相對(duì)豐度最相似。說(shuō)明細(xì)菌菌群演替明顯分為兩個(gè)階段。真菌門水平物種熱圖（圖2B）表明，CO期和MA期物種組成和相對(duì)豐度最相似（距離最近、枝長(zhǎng)最短），TH期與其它階段的物種組成和相對(duì)豐度差異很大。

表6 細(xì)菌屬水平優(yōu)勢(shì)菌群

表7 真菌屬水平優(yōu)勢(shì)菌群

2.3.2 屬水平聚類分析 細(xì)菌屬水平物種熱圖（圖3A）表明，CO期與MA期物種組成和相對(duì)豐度最相似（距離最近、枝長(zhǎng)最短），TH期與其它階段的物種組成和相對(duì)豐度差異很大。真菌屬水平物種熱圖（圖3B）表明，MA期與CO期物種組成和相對(duì)豐度最相似（距離最近、枝長(zhǎng)最短），TH期與IM期物種組成和相對(duì)豐度最相似。

圖2 細(xì)菌（A）和真菌（B）門水平物種相對(duì)豐度熱圖

圖3 細(xì)菌（A）和真菌（B）屬水平物種相對(duì)豐度熱圖

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了添加功能菌劑條件下牛糞高溫堆制過(guò)程中細(xì)菌和真菌的種群變化。16S rRNA測(cè)序結(jié)果表明，4個(gè)階段樣本共產(chǎn)生965個(gè)OTU；ITS測(cè)序結(jié)果表明，4個(gè)階段樣本共產(chǎn)生164個(gè)OTU。細(xì)菌OTU數(shù)量為真菌的5.9倍，表明牛糞高溫堆制期間細(xì)菌為主導(dǎo)菌群。細(xì)菌OTU分析結(jié)果表明，降溫期（CO）和熟化期（MA）細(xì)菌物種數(shù)量和種類比升溫期（IM）及高溫期（TH）明顯提高，說(shuō)明物料經(jīng)高溫后更有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。真菌TH期和MA期種類和數(shù)量比IM期和CO期多，說(shuō)明細(xì)菌和真菌的演替模式不同。高溫期真菌數(shù)量和種類大幅度增加，其菌絲的物理作用以及各種胞外酶均會(huì)促進(jìn)堆肥的發(fā)酵［15］。熱圖分析表明，細(xì)菌屬水平CO期和MA期聚為一簇，真菌表現(xiàn)了相同的結(jié)果。說(shuō)明進(jìn)入降溫期和熟化期物種趨于相對(duì)穩(wěn)定。研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌各時(shí)期共有的OTU占總數(shù)量的比例為30.1%，而真菌共有的OTU占總數(shù)量的比例為12.8%，說(shuō)明不同堆制階段細(xì)菌種群相對(duì)穩(wěn)定，真菌種群演替更劇烈。

細(xì)菌高溫期的優(yōu)勢(shì)菌群組成有明顯特點(diǎn)，Sphingobacterium（鞘氨醇桿菌屬）、Pseudoxanthomonas（假黃色單胞菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Thermovum（嗜熱菌屬）相對(duì)豐度大幅度提高。鞘氨醇桿菌具有降解纖維素功能，其相對(duì)豐度增加，有助于糞便物料中纖維素的降解；假黃色單胞菌屬菌株常用于生物防治，對(duì)污染物降解也具有很好的作用，其相對(duì)豐度提高，可提升發(fā)酵物料的功能；嗜熱菌屬高溫期相對(duì)豐度增加，有利于物料高溫發(fā)酵［20，21］。本研究發(fā)酵牛糞高溫菌劑為芽孢桿菌，其相對(duì)豐度大幅度提高，與高溫期大量繁殖有關(guān)。Pedobacter（土地桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）和Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）大多數(shù)為有害菌，高溫發(fā)酵后相對(duì)豐度極低甚至檢測(cè)不到，說(shuō)明高溫發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)物料無(wú)害化。MA期Actinomadura（放線菌屬）和Streptomyces（鏈霉菌屬）豐度提高，兩者是土壤生境中最重要的菌，能產(chǎn)生多種酶 （蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶）、維生素和有機(jī)酸等，具有促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)降解和增加土壤養(yǎng)分的功能［22］。

真菌屬數(shù)量在高溫期和熟化期明顯增多。其中Aspergillus（曲霉屬）能引起多種物質(zhì)降解和霉腐，Chaetomium（毛殼屬）具有降解纖維素和生物防治功能，Humicol a（腐質(zhì)霉屬）能產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶，還有存在于牛糞、腐葉中的腐生菌Cephaliophora（頭梗霉屬）、Ascobolus（糞盤菌屬），具有漆酶分泌功能的Coprinopsis（鬼傘屬）等，在牛糞和秸稈高溫腐熟過(guò)程中均具有重要作用［13，14］。

綜上所述，各發(fā)酵階段細(xì)菌種群和數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌。高溫期具有物質(zhì)降解和轉(zhuǎn)化功能，真菌種類及數(shù)量明顯增加，說(shuō)明真菌對(duì)物料溫度升高和腐熟過(guò)程起重要作用。高溫期細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群具有嗜熱、降解結(jié)構(gòu)物質(zhì)、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的功能特點(diǎn)，有害菌的消失主要發(fā)生在高溫期。后續(xù)將研究微生物種群代謝組學(xué)機(jī)理，為高溫堆制生產(chǎn)功能有機(jī)肥提供理論和技術(shù)支撐。