基于羅丹明B熒光猝滅構(gòu)建食用油脂過氧化值檢測模型

李靜雅 白 瑩 薛林科 張小林

(甘肅醫(yī)學(xué)院,平?jīng)?744000)

油脂是日常飲食三大產(chǎn)能營養(yǎng)素之一[1]，過氧化值反映了油脂變質(zhì)程度[2]。目前過氧化值的檢測方法很多,主要有碘量法[3-6]、光度法[7-8]，紅外光譜法[9]、色譜法[10]、電化學(xué)分析法[11]等。碘量法采用氧化-還原滴定法,是油脂過氧化值國標(biāo)通用分析方法[12]，受溶液pH值、溫度、加水量及搖動(dòng)速度、滴定終點(diǎn)判斷等諸多因素影響,使得測定值波動(dòng)性大,重復(fù)性差；同時(shí),該法取樣量大,僅適用于含0.4 mmol/kg以上過氧化物的測定，靈敏度低，很難做到微量分析。熒光光譜技術(shù)因其靈敏度高,選擇性強(qiáng),試樣用量少等優(yōu)點(diǎn)被關(guān)注，Santas等[12]以二苯基-1-芘基膦試劑為熒光探針，完成食用油脂過氧化值熒光光譜檢測，測定了43個(gè)樣品的過氧化值(0～15 mmol/kg)；Guzmán等[13]利用熒光光譜結(jié)合多變量分析技術(shù)研究了橄欖油的各種質(zhì)量參數(shù)，為測定油脂的過氧化值提供了又一個(gè)有效的方法。

羅丹明B(Rhodamine B，RhB)俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，稀釋液有強(qiáng)烈熒光，可溶性碘(I3-)與其有締合反應(yīng)[14-16]。油脂中過氧化物與過量碘化鉀(I-)反應(yīng)生成水溶性碘(I3-),締合反應(yīng)使其熒光猝滅，熒光猝滅程度取決于油脂中過氧化物含量。本實(shí)驗(yàn)研究了有過氧化物存在時(shí)KI-RhB體系的熒光光譜特性，提出了用羅丹明B染料熒光猝滅法測定油脂過氧化值的新方法。羅丹明B熒光猝滅法簡便快捷，靈敏度高，過氧化物最低檢出量達(dá)到0.06 mmol/kg，更適合于油脂過氧化值微量分析。通過油脂空白試驗(yàn)，有效克服了共存還原性物質(zhì)及有機(jī)溶劑的干擾，測定過程不受樣品濁度和色度影響，方法的選擇性進(jìn)一步提高。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

930N熒光分光光度計(jì)。

30%H2O2、羅丹明B、醋酸、醋酸鈉、冰醋酸、碘化鉀、三氯甲烷：分析純。

1.2 溶液配制

H2O2對(duì)照液：取25 mL的30%H2O2稀釋成250 mL,KMnO4標(biāo)定，根據(jù)標(biāo)定值二次稀釋為1 mmol/L；羅丹明B溶液∶1.0×10-4mol/L；飽和碘化鉀溶液:稱取14 g碘化鉀,加10 mL水溶解；三氯甲烷-冰乙酸混合液(2∶3)，混勻；0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH4.5)。食用植物油作分析樣品，均來自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.3 方法原理與量值追溯

油脂中的過氧化物與碘化鉀定量反應(yīng)生成碘單質(zhì)(I2)

ROOH(過氧化物)+2HI→H2O+I2+ROH

過量碘化鉀作助溶劑形成可溶性碘(I3-)：

I2+I-=I3-

在弱酸環(huán)境下，I3-與羅丹明B陽離子通過靜電引力形成締合物，締合反應(yīng)導(dǎo)致羅丹明B熒光猝滅，猝滅程度決定過氧化物含量。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣液制備

稱取3～5 g油脂樣品(精確到0.000 1 g)于25 mL容量瓶，用三氯甲烷-冰乙酸混合溶劑(2∶3)溶解并稀釋定容，取樣前再次充分振蕩。

1.4.2 樣品測定

準(zhǔn)確移取100 μL樣液于50 mL容量瓶中，加飽和KI溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置反應(yīng)25 min，加1.00×10-4mol/L羅丹明B 4.00 mL，0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)5.00 mL，蒸餾水定容，靜置20 min，以365 nm作激發(fā)波長，580 nm作發(fā)射波長，1.0×10-6mol/L羅丹明B作為靈敏度調(diào)試液，測定熒光強(qiáng)度F。同時(shí)完成油脂空白試驗(yàn)(不加KI)F0測定，根據(jù)熒光猝滅程度ΔF(ΔF=F0-F)確定油脂過氧化值。

注：X為過氧化值/mmol/kg；k為方程斜率(k=7 598L/mmol)；m為油脂樣品質(zhì)量/g。

1.4.3 過程比較

碘量法與熒光猝滅法過程比較見表1。

表1 兩種方法測定過程比較

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜與模型方程

當(dāng)λex=365 nm時(shí)，羅丹明B在580 nm處有一最大熒光峰(圖1曲線1)，加入過量KI時(shí)，羅丹明B熒光值不受影響，加入H2O2后，I-被氧化為I3-，羅丹明B與I3-締合反應(yīng)導(dǎo)致熒光猝滅，熒光強(qiáng)度迅速下降(圖1曲線2)；熒光猝滅程度隨H2O2濃度增大而增強(qiáng)(圖1曲線3)。

注：1.RhB+I-,2.RhB+I-+H2O2(0.005mmol/L),3.RhB+I-+H2O2(0.018mmol/L)。圖1 不同體系的熒光光譜

取1 mmol/L H2O2對(duì)照液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，再分別加入0.10 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，以此代替油脂樣品，按方法完成F和F0測定，計(jì)算ΔF，以濃度c(mmol/L)為橫坐標(biāo)，ΔF為縱坐標(biāo)，繪制H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建油脂過氧化值模型方程。結(jié)果表明，在0.000～0.024 mmol/L范圍內(nèi)，H2O2濃度c與熒光強(qiáng)度變化值ΔF有良好的線性關(guān)系：ΔF=7 598c-0.892 7，r=0.998 9，按實(shí)驗(yàn)方法平行測定H2O2空白11次，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為0.012，3倍的信噪比求得過氧化氫檢測限為4.74×10-6mmol/L，當(dāng)取0.02 g油樣稀釋時(shí)，得出油脂過氧化值最低檢出量為0.06 mmol/kg。試驗(yàn)選擇以365 nm作為激發(fā)波長，檢測580 nm發(fā)射波長處溶液的熒光強(qiáng)度。

2.2 羅丹明B用量優(yōu)化

在pH 4.5環(huán)境下考察不同體積羅丹明B溶液的熒光特性。結(jié)果表明，在0～4 mL范圍內(nèi)羅丹明B稀釋液熒光強(qiáng)度與1.0×10-4mol/L羅丹明B加入體積有線性關(guān)系，當(dāng)稀釋液中c(RhB)≥8.0×10-6mol/L時(shí)，V(RhB)>4mL，熒光強(qiáng)度趨于恒定，羅丹明B分子間發(fā)生了聚合[18]。故1.0×10-4mol/L羅丹明B取量確定為4.00 mL。

2.3 溶液pH的影響

取1 mmol/L H2O22.00 mL，用0.1 mol/L鹽酸改變反應(yīng)體系pH值，測定pH2～6范圍內(nèi)“H2O2+I-+RhB”體系熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，pH=4.0～5.0時(shí)，猝滅程度最大，熒光強(qiáng)度達(dá)到最低。H2O2是含氧型氧化劑，半反應(yīng)有H+參與，但酸度過高時(shí)，部分H2O2發(fā)生分解。故實(shí)驗(yàn)選用pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作反應(yīng)介質(zhì)。

2.4 飽和KI溶液添加量

KI有雙重功效，既是還原劑，又是助溶劑，為促進(jìn)碘合離子(I3-)形成，加大羅丹明B熒光猝滅程度；碘化鉀加入量過少會(huì)使反應(yīng)不充分，測定結(jié)果偏小，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；過多則會(huì)因碘化鉀空氣氧化產(chǎn)生誤差。取1 mmol/L H2O2對(duì)照液2.00 mL，其他條件不變，僅改變飽和碘化鉀溶液加入量，按“1.4”測定方法完成F測定。結(jié)果表明，當(dāng)飽和碘化鉀的添加量超過0.4 mL后,即使碘化鉀的添加量增加,溶液的熒光強(qiáng)度依然趨向穩(wěn)定值,說明此時(shí)碘化鉀的添加量已經(jīng)能夠滿足反應(yīng)需求,因此確定飽和碘化鉀的添加量為0.5 mL。

2.5 反應(yīng)時(shí)間影響

碘化鉀與油樣中過氧化物的反應(yīng)時(shí)間決定了油樣中過氧化物能否完全反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間過長或過短都可在一定程度上影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。取1 mmol/L H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL，其他條件不變，僅改變加入碘化鉀后的靜置反應(yīng)時(shí)間，按“1.4”測定方法完成F測定，不同反應(yīng)時(shí)間的溶液熒光強(qiáng)度變化情況如圖2所示。

圖2 氧化反應(yīng)時(shí)間影響

過氧化物與碘化鉀混合時(shí)間直接決定了熒光猝滅程度，反應(yīng)進(jìn)行25 min后，溶液熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間變化不大,趨近一個(gè)穩(wěn)定值,說明此時(shí)過氧化物已經(jīng)和碘化鉀反應(yīng)較為充分,繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間也不能使溶液熒光強(qiáng)度有較大的變化,因此反應(yīng)時(shí)間定為25 min。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察締合反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響(圖3)。結(jié)果表明，加入羅丹明B后，熒光強(qiáng)度隨靜置時(shí)間延長而減小，20 min后熒光強(qiáng)度趨于恒定。故加羅丹明B后靜置時(shí)間確定為20 min。

圖3 熒光猝滅反應(yīng)時(shí)間影響

2.6 樣品分析

取不同植物油樣品，按“1.4”方法完成過氧化值測定，并與碘量法作比較，測定結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果(n=6)

利用所建方法對(duì)不同待測油樣過氧化值進(jìn)行了6次平行測定,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)控制在2.8%范圍內(nèi)，測定結(jié)果與碘量法基本一致，測量誤差小于5%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于“H2O2-I--RhB”反應(yīng)體系建立了油脂過氧化值檢測模型，油脂加入前后熒光強(qiáng)度變化量(ΔF)體現(xiàn)了油脂過氧化值，方法簡單且具有很好的靈敏度，用于油脂過氧化值微量檢測，最低檢出量為0.06 mmol/kg；碘化鉀空白實(shí)驗(yàn)有效克服有機(jī)溶劑及油脂中共存還原性物質(zhì)干擾。