高溫高壓膨化法降解小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及降解產(chǎn)物解析的研究

胡學(xué)春 任凌云 王麗娟 王 駿 張艷俠 金增偉 吳真真 王瑞杰 郭啟雷

(山東省糧油檢測中心1 ，濟(jì)南 250101) (山西糧食質(zhì)量監(jiān)測中心 2 ，太原 030024) (山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 3 ,濟(jì)南 250101) (安捷倫科技(中國)有限公司 4 ,北京 100102)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是由鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢族化合物中的一種，屬于?類單端孢霉烯族毒素，是一種有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，因動(dòng)物食后嘔吐，又名嘔吐毒素。

小麥在生長期、成熟期和收獲期，都可感染嘔吐毒素。鐮刀菌能在1～39 ℃的溫度范圍內(nèi)生長，最適溫度為25～30 ℃，最適產(chǎn)毒溫度通常在8～12 ℃之間。土壤幾乎包含了自然界所有菌類，我國高產(chǎn)量的方法之一是密集種植，陽光不能照射土壤殺死其中的真菌，當(dāng)遇到陰雨連綿，溫度濕度適宜時(shí)，土壤中的真菌快速繁殖，小麥通過根系把土壤中的真菌吸收進(jìn)入果實(shí)。在成熟期，小麥果殼張開，尤其是在淮河流域，此時(shí)正是梅雨季節(jié)，雨水進(jìn)入籽粒果殼內(nèi)，果殼降溫收縮閉合，包含住雨水，此時(shí)溫度高、濕度大，小麥籽粒特別容易感染真菌。在收獲期，糧食籽粒特別是在胚芽部，此處水分大、富含糖、脂肪和蛋白質(zhì)，是真菌的良好培養(yǎng)基，適宜真菌的快速生長。

圖1 DON分子結(jié)構(gòu)式

2006年，歐盟規(guī)定嘔吐毒素在粗谷物中的最大限最為1 250 μg/kg[2]。2001年食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)第56次會(huì)議首次對(duì)DON進(jìn)行了評(píng)估，根據(jù)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，JECFA提出DON的暫定每日最大耐受攝入量( provisional maximum tolerable daily in-take，PMTDI)為1 μg/kgbw。2010年JECFA第72次會(huì)議維持了DON的PMTDI值為1 μg/kgbw[3,4]。GB 2761—2017中規(guī)定小麥及其制品中DON的最大允許限量為1 000 μg/kg[5]。

目前，國內(nèi)研究小麥(糧食)中DON降解的主要方法有風(fēng)選除去赤霉病粒、紫外線照射法；臭氧水浸泡法降解赤霉病小麥中的 DON[6]，DON的降解率可達(dá)19.99%，增大濃度、延長浸泡時(shí)間，降解率最大可到44.12%；生物發(fā)酵法降解糧食及其制品中真菌毒素[7]，酒糟降解后DON的含量≤500 μg/kg，還有蒙脫石物理吸附法、氨發(fā)酵法等。

本研究分析了小麥中DON的降解方法及降解產(chǎn)物，感染DON的小麥經(jīng)高溫高壓膨化處理，不添加任何化學(xué)試劑，可使DON降解率達(dá)61.9%～81.1%，降解產(chǎn)物經(jīng)UHPLC-QTOF-MS分析，通過全掃描模式采集數(shù)據(jù)，利用設(shè)備配置的粒子群優(yōu)化算法(Particle Swarm optimization, PSO)，對(duì)不同質(zhì)核比范圍內(nèi)分段優(yōu)化，考慮同位素權(quán)重計(jì)算精確質(zhì)量數(shù)，利用分子式生成(MFG)功能生成元素組成，通過二級(jí)質(zhì)譜圖檢索比對(duì)譜庫(PCDL庫)，與譜庫已知化合物分析確認(rèn)降解產(chǎn)物的分子式，根據(jù)DON的已知結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵能推測可能的分解產(chǎn)物，通過儀器內(nèi)置的結(jié)構(gòu)解析輔助軟件(MSC)，對(duì)未知結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷，得到至少5個(gè)分解產(chǎn)物，確定降解產(chǎn)物可能的分子結(jié)構(gòu)，降解產(chǎn)物之一3-epi-DON的毒性是DON的1/350[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

污染DON不同程度的小麥 ，1#小麥DON含量731 μg/kg、2#小麥DON含量8 995 μg/kg、3#小麥DON含量4 023 μg/kg；DON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，5 mg，純度98.0%；DON參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Lot # D-C-622，含量1 900 μg/kg；甲醇、乙腈，色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

膨化罐：304不銹鋼，自制(見圖2)；Waters e2695高效液相色譜儀，UHPLC-QTOF-MS 6545高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀。

1.2 方法

1.2.1 潤麥

取500 g小麥于潤麥瓶中，加入水至實(shí)驗(yàn)要求的水分，充分混合均勻，密閉放置24 h，使水被小麥完全吸收。

加水量按公式(1)計(jì)算：

w水=w樣(m1-m0)/(100-m1)

(1)

式中：w水為需要加水?dāng)?shù)量/g；w樣為實(shí)驗(yàn)樣品的數(shù)量/g；m1為樣品需要加到的水分/%；m0為樣品原始水分/%。

1.2.2 小麥中DON的降解脫毒處理

實(shí)驗(yàn)用膨化機(jī)膨化腔2.5 L，轉(zhuǎn)速30 r/min和60 r/min 2擋可以選擇，煤氣加熱，設(shè)計(jì)最高使用壓力1.3 MPa。

將1.2.1潤麥處理后的小麥300 g置于高溫高壓膨化機(jī)中，在不同水分、壓力下膨化處理，控制加熱時(shí)間和轉(zhuǎn)速，使膨化腔達(dá)到規(guī)定的壓力后，啟動(dòng)泄壓開關(guān)，達(dá)到膨化的目的，冷卻至室溫后粉碎，粉碎后的樣品檢測其DON含量，確定降解脫毒的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.2.3 DON 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)

將5 mg DON 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解于1 mL乙腈中，并稀釋成500 μg /mL 的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，將膨化罐置于烘箱中加熱至80 ℃，把1 mL DON乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到膨化罐內(nèi)部，使乙腈自然揮發(fā)干，將膨化罐置于高溫高壓膨化機(jī)中，按1.2.2確定的最佳條件隨同樣品一起膨化處理。

圖2 膨化罐結(jié)構(gòu)示意圖(單位mm)

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 按照GB 5009.111—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定小麥降解脫毒處理前后的DON含量。

1.2.4.2 按照 LS/T 6113—2015《糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定 膠體金快速定量法》測定小麥降解脫毒處理前后的DON含量。

1.2.4.3 高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀解析DON降解產(chǎn)物

UHPLC-QTOF-MS實(shí)驗(yàn)條件為，液相色譜柱: Agilent Eclipse Plus C18(RRHD)(柱長150 mm，柱內(nèi)徑 3.0 mm, 填料粒徑1.8μm)；流動(dòng)相: A相：水溶液(0.5 mmol/L 氟化銨+ 4.5 mmol/L 甲酸銨+ 0.1% 甲酸)；B相：甲醇溶液 (0.5 mmol/L 氟化銨+ 4.5 mmol/L 甲酸銨+ 0.1% 甲酸)；梯度洗脫；流速: 0.40 mL/min；柱溫: 40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；離子源: 電噴霧離子源；質(zhì)量數(shù)掃描范圍: 40m/z～1 000m/z(+)；40m/z～1 100m/z(-) ；干燥氣溫度: 300 ℃；干燥氣流量: 7 L/min；霧化器壓力: 40 psi；鞘氣溫度: 375 ℃；鞘氣流量: 12 L/min；毛細(xì)管電壓: 3 500 V/4 000 V；噴嘴電壓: 0 V/1 000 V；采集頻率：2 Spec/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定結(jié)果準(zhǔn)確度的質(zhì)量控制

不同方法測定DON的結(jié)果均符合GB 5009.111—2016中25%的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)要求，也達(dá)到DON參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)第一范圍800～1 000 μg/kg的要求，從而確定本研究對(duì)DON測定結(jié)果的可靠性。

2.2 小麥中DON降解條件選擇實(shí)驗(yàn)

2.2.1 膨化機(jī)檢漏和預(yù)熱

檢漏和預(yù)熱：在膨化腔加入100 mL水，關(guān)閉密封閥，檢查是否漏水。開啟自動(dòng)旋轉(zhuǎn)器30 r/min、點(diǎn)火加熱至1.3 MPa，關(guān)閉加熱和旋轉(zhuǎn)器，開啟膨化開關(guān)。如果有漏氣，檢查或更換密封墊片后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膨化壓力在0.7 MPa以下時(shí)，轉(zhuǎn)速選擇30 r/min和60 r/min均可，膨化壓力在0.7 MPa以上時(shí)，應(yīng)選擇轉(zhuǎn)速60 r/min，保證受熱均勻和膨化效果。

2.2.2 水分對(duì)DON降解的影響

將2#小麥潤濕至水分為15%、20%、25%，分別置于高溫高壓膨化機(jī)中，調(diào)整壓力為0.7 MPa， 小麥降解后DON檢測結(jié)果見表1。

表1 水分對(duì)降解的影響結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水分對(duì)降解脫毒效果影響不大，考慮到能耗，選擇20%。

按照設(shè)想，水分的增加會(huì)有利于小麥中DON的降解。按照克拉伯龍方程PV=nRT,1 moL 水完全氣化，在理想狀態(tài)下的體積是22.4 L，體積膨脹1 244倍，飽和水蒸氣在0.7 MPa時(shí)的溫度約165 ℃，在壓力P一定時(shí)，v1/T1=v2/T2，當(dāng)溫度從20 ℃(293 K)升高到165 ℃(438 K)時(shí)，體積增加1.5倍，即1 moL水完全氣化，溫度達(dá)到165 ℃時(shí)的體積膨脹1 866倍，水分體積的瞬間爆破，有可能將小麥連同DON一起撕裂，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，增加水分并不會(huì)提高降解效果。

2.2.3 壓力對(duì)DON降解的影響

將2#小麥潤濕至水分為20%，分別置于高溫高壓膨化機(jī)中，調(diào)整壓力為0.7、1.0、1.3 MPa，小麥降解后DON檢測結(jié)果見表2。

表2 壓力對(duì)降解的影響結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，壓力是影響降解脫毒效果的關(guān)鍵因素，選擇壓力1.3 MPa。

膨化時(shí)的溫度、壓力是影響膨化效果的關(guān)鍵因素，溫度是由壓力確定的，所以調(diào)節(jié)壓力是本實(shí)驗(yàn)的主要控制條件，但因本膨化機(jī)設(shè)計(jì)的最高使用壓力是1.3 MPa，為安全計(jì)只能使用到最高設(shè)計(jì)壓力。增加壓力即提高溫度，分子獲得足夠能量，化學(xué)鍵斷裂，說明在高溫高壓下瞬間爆破使化學(xué)鍵獲得足夠的能量是DON降解的必要條件。

2.2.4 小麥中DON降解的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將1#、2#、3#小麥潤濕至水分為20%，置于高溫高壓膨化機(jī)中，在1.3 MPa壓力下，在不同時(shí)間進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，在不同的實(shí)驗(yàn)室測定其原料和處理后產(chǎn)品的DON含量，結(jié)果見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一年內(nèi)不同時(shí)間，對(duì)不同DON含量的小麥進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，降解率在61.9%～81.1%，平均75.2%，說明本方法對(duì)于污染不同濃度DON的小麥降解脫除效果是可重復(fù)實(shí)現(xiàn)的，方法是可靠的。降解率的差異，應(yīng)該是樣品檢測及實(shí)驗(yàn)參數(shù)的差異引起的，而不是方法的不穩(wěn)定引起的。

表3 DON重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表

2.3 DON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的降解脫毒處理及其降解產(chǎn)物的分析

2.3.1 DON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的降解脫毒處理

將1.2.3處理的膨化罐隨小麥在壓力為1.3 MPa時(shí)膨化處理，然后將膨化罐置于乙腈中浸泡清洗罐中的DON及其降解產(chǎn)物，濃縮后用UHPLC-QTOF-MS解析其降解產(chǎn)物。

2.3.2 主要降解產(chǎn)物的變化方式和降解產(chǎn)物的基本參數(shù)

根據(jù)UHPLC-QTOF-MS分析檢定，解析出以下5種DON降解產(chǎn)物，見表4和圖3。

表4 DON主要降解產(chǎn)物

2.3.3 DON主要降解產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜圖

DON降解的主要途徑為DON的3-OH的β、α異構(gòu)化和酮基化及內(nèi)醚鍵的水化反應(yīng)、C5、C6位基團(tuán)的降解脫落等。3-OH和內(nèi)醚結(jié)構(gòu)是 DON的重要毒位點(diǎn)，3-OH的異構(gòu)化和內(nèi)醚鍵水化反應(yīng)使內(nèi)醚鍵的斷裂對(duì)DON毒性的降低意義重大。

2.3.3.1 主要降解產(chǎn)物之一

水化-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配圖，見圖3。

圖3 水化-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配圖

圖3a為水化-DON的保留時(shí)間和豐度圖，圖3b為水化-DON的同位素分布的理論值(方框)和實(shí)際值(方框內(nèi)棒狀)完美匹配，基本確定了降解產(chǎn)物水化-DON的分子式、分子結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量，化學(xué)反應(yīng)方程結(jié)構(gòu)式如圖4。

圖4 DON發(fā)生水化反應(yīng)生成水化-DON的反應(yīng)結(jié)構(gòu)方程式

雜環(huán)內(nèi)醚結(jié)構(gòu)是目前已知DON的重要毒位點(diǎn)之一，水化反應(yīng)是醚鍵打開，結(jié)合一個(gè)H2O分子，此處分子鍵的斷裂對(duì)毒性的降低意義重大。 此處化學(xué)鍵的斷裂，意味著DON的雜環(huán)結(jié)構(gòu)變成不穩(wěn)定的單鍵連接，猜測雜環(huán)結(jié)構(gòu)完全斷裂的可能性極大。

2.3.3.2 主要降解產(chǎn)物之二

3-epi-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配對(duì)比圖見圖5。

圖5a為DON和3-epi-DON的保留時(shí)間和豐度對(duì)比圖，圖5b為DON和3-epi-DON的同位素分布的理論值(紅框)和實(shí)際值(紅框內(nèi)棒狀)匹配對(duì)比圖，基本確定了3-epi-DON的分子式、分子結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量。

圖5 DON和3-epi-DON的保留時(shí)間和同位素分布匹配對(duì)比圖

盡管3-epi-DON只是DON的3位羥基發(fā)生差向異構(gòu)，是 DON的同分異構(gòu)體，與DON的分子式、分子質(zhì)量、質(zhì)核比一樣，但二者的分子結(jié)構(gòu)式不同，保留時(shí)間有較大差異，這也說明了二者的化學(xué)性質(zhì)有較大差異，也從另一方面證明了3-epi-DON與DON的毒性有較大差異。

3 結(jié)論

污染了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的小麥，經(jīng)高溫高壓膨化處理，61.9%～81.1%的DON發(fā)生了降解反應(yīng)，已經(jīng)解析出的降解產(chǎn)物有水化-DON、3-epi-DON、3-kedo DON；降解機(jī)理是DON分子化學(xué)鍵獲得足夠能量發(fā)生斷裂，其斷裂途徑主要是DON的3位羥基發(fā)生差向異構(gòu)和酮基化，1位內(nèi)醚發(fā)生水化反應(yīng)；壓力是影響降解脫毒效果的關(guān)鍵因素；通過UHPLC-QTOF-MS基本確定了DON部分裂解產(chǎn)物的分子式有C15H20O6、C15H18O6、C15H22O7，分子質(zhì)量分別是296.126 0、294.110 3、314.136 6 ku。