褐化抑制對(duì)‘鳳丹’試管苗擴(kuò)繁培養(yǎng)中酚類物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性的影響

王若馨，王華芳

(1. 北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

‘鳳丹’(PaeoniaostiiT. Hong et J. X. Zhang var.‘lishizhenii’ B. A. Shen)屬芍藥科芍藥屬牡丹組(Paeoniasect. Moutan)楊山牡丹變種[1]，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，全國(guó)廣為栽培，為中藥牡丹皮(丹皮)主要品種，亦作觀賞品種繁殖砧木。花單瓣，結(jié)實(shí)量大，籽油產(chǎn)量高，集觀賞、藥用與油用價(jià)值于一體。21世紀(jì)初將‘鳳丹’拓展為新興木本油料作物，其籽油不飽和脂肪酸含量92%以上，其中α-亞麻酸含量達(dá)44%，具有調(diào)節(jié)血壓、血糖、血脂，增強(qiáng)免疫力，抗氧化等功效[2-4]。對(duì)‘鳳丹’藥食同源優(yōu)良品種的繁育研究具有重要科學(xué)和生產(chǎn)實(shí)際意義。

‘鳳丹’傳統(tǒng)繁殖方式包括播種、嫁接、分株等，實(shí)生苗個(gè)體差異大，播種難以保持母株優(yōu)良性狀，嫁接和分株受材料、季節(jié)等諸多限制，繁殖系數(shù)低，難以實(shí)現(xiàn)工廠化標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)[5]。植物組織培養(yǎng)能實(shí)現(xiàn)快速繁育并保持母株優(yōu)良性狀。牡丹組織培養(yǎng)于1965年首次報(bào)道用胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織[6]，此后以花藥[7]、腋芽[8]、莖尖[9]、葉片和葉柄[10]、子葉[11]等為外植體建立組織培養(yǎng)體系?！P丹’較一些草本植物含有較多酚類化合物，酚類物質(zhì)分布在液泡中，當(dāng)組織剪切或受傷時(shí)，酚類與質(zhì)體或細(xì)胞膜上的多酚氧化酶(PPO)的區(qū)域化被打破，酶促反應(yīng)使酚類被氧化，產(chǎn)生褐色有害的醌類物質(zhì)，導(dǎo)致組織死亡[12]。據(jù)報(bào)道，‘鳳丹’鱗芽在培養(yǎng)基上的第10天褐化率可達(dá)64.3%[13]。褐化成為‘鳳丹’快速繁殖的主要瓶頸，嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。近年來(lái)，用抗氧化劑抑制‘鳳丹’培養(yǎng)物褐化也有報(bào)道，‘鳳丹’擴(kuò)繁培養(yǎng)基中添加維生素C(Vc)15 mg/L、核黃素(VB2)20 mg/L時(shí)，褐化級(jí)別由3級(jí)降為1級(jí)[5]。低溫結(jié)合3 mg/L硝酸銀(AgNO3)處理可使‘鳳丹’鱗芽褐化率降至29.15%[14]。

褐化抑制機(jī)理的研究可為降低‘鳳丹’試管苗褐化率及提高繁殖效率提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，而這方面的研究鮮有報(bào)道。總酚含量、多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)等與酶促褐化密切相關(guān)[12]。本研究以‘鳳丹’不定芽為材料，選擇不同濃度的維生素C、硝酸銀以及不同時(shí)間的 4 ℃低溫、暗處理，研究多種處理的抗褐化與擴(kuò)繁效果；測(cè)定總酚含量、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性，探討‘鳳丹’褐化發(fā)生的生理生化機(jī)理，為促進(jìn)其組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料‘鳳丹’(PaeoniaostiiT.Hong et J. X. Zhang var. ‘lishizhenii’ B. A. Shen)為筆者實(shí)驗(yàn)室繼代保存，取自北京順義基地(40.2°N，116.5°E)，年平均降水量610 mm，年平均氣溫11.5 ℃，最高溫度42.0 ℃，最低溫度-19.1 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 不同抗褐化處理對(duì)‘鳳丹’試管苗褐化及生長(zhǎng)的影響 選擇生長(zhǎng)健壯、表型一致的不定芽接種到改良WPM培養(yǎng)基[15]+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA30.05 mg/L, 培養(yǎng)基分別添加抗褐化劑維生素C(50、75、100和125 mg/L)、AgNO3(20、40、60、80 mg/L)、黑暗預(yù)處理(1、3、5、7 d)、4 ℃低溫預(yù)處理(1、3、5 d)，以不處理為對(duì)照進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為(24±1) ℃，日光燈光密度為36 μmol/(m2·s)，光照16 h /黑暗8 h。每個(gè)處理6瓶，每瓶5個(gè)芽，重復(fù)3次。在轉(zhuǎn)接后10、20、30 d取材分別統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。

轉(zhuǎn)接后30 d統(tǒng)計(jì)褐化率(%)、褐化半徑(褐色物質(zhì)的溢出半徑)、生長(zhǎng)量(g)、增殖系數(shù)和死亡率(%)。增值芽的標(biāo)準(zhǔn)是有獨(dú)立莖段且莖段長(zhǎng)≥0.5 cm，莖基部直徑≥0.4 cm，且能夠單獨(dú)切割下來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)的芽。褐化率=褐化數(shù)/接種數(shù)×100%；增殖系數(shù)=30 d的不定芽總數(shù)/接種的芽總數(shù)；在超凈工作臺(tái)上，將試管苗置于分析天平上稱量，計(jì)算試管苗的生長(zhǎng)量，生長(zhǎng)量=W1-W0(W1為30 d后的質(zhì)量，W0為轉(zhuǎn)接時(shí)質(zhì)量)；死亡率=死亡不定芽數(shù)/不定芽總數(shù)×100%。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 總酚含量測(cè)定參照毛沛琪等[16]方法略作修改。酶液制備參照毛沛琪等[16]方法；超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑NBT光化還原法[17]；過(guò)氧化物酶(POD)酶活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[17]；多酚氧化酶(PPO)酶活性的測(cè)定采用鄰苯二酚比色法[18]。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2016計(jì)算數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)誤，IBM Statistical Package for Social Sciences 23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并進(jìn)行Duncan’s多重檢驗(yàn)及皮爾遜相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐化處理對(duì)‘鳳丹’試管苗褐化率及褐化半徑的影響

不同抗褐化處理對(duì)‘鳳丹’試管苗的褐化率、褐化半徑的影響如表1所示。AgNO3不同濃度處理的褐化率差異較大，褐化率隨處理濃度的增大呈先降低后升高的趨勢(shì)。其中， AgNO360 mg/L的處理褐化率最低，為23.33%，試管苗褐化程度淺，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，其他濃度處理的褐化率與對(duì)照組差異不顯著。AgNO3處理的褐化半徑與對(duì)照組差異不顯著。隨著Vc濃度的升高，褐化率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。培養(yǎng)基中分別添加Vc 75 mg/L和100 mg/L的試管苗褐化率顯著低于對(duì)照組，分別為29.44%和31.59%，褐化程度較淺，滲出的褐色物質(zhì)較少，Vc 75 mg/L與100 mg/L處理之間無(wú)顯著差異，褐化半徑與對(duì)照組差異也不顯著。暗處理3 d與4 ℃低溫3 ～5 d均能顯著降低褐化率，褐化物質(zhì)滲出物減少，褐化半徑與對(duì)照差異不顯著。以上表明在不同抗褐化處理控制‘鳳丹’試管苗褐化方面，AgNO360 mg/L處理效果最好，褐化率降至23.33%。

2.2 抗褐化處理對(duì)‘鳳丹’試管苗增殖系數(shù)、生長(zhǎng)量及死亡率的影響

抗褐化處理對(duì)‘鳳丹’試管苗的增殖系數(shù)、生長(zhǎng)量及死亡率有影響(表1)。對(duì)照組試管苗的增殖系數(shù)為1.76，生長(zhǎng)量為0.23 g，死亡率為 2.22%。培養(yǎng)基中添加Vc 50～125 mg/L，增殖系數(shù)與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)。添加Vc 100～125 mg/L則試管苗生長(zhǎng)量顯著降低，最低為0.16 g，且死亡率顯著升高，同時(shí)植株出現(xiàn)玻璃化。添加AgNO360 mg/L能顯著提高試管苗增殖系數(shù)至2.28，生長(zhǎng)量達(dá)0.33 g；添加AgNO340～60 mg/L均能顯著提高試管苗生長(zhǎng)量，同時(shí)植株生長(zhǎng)迅速，且無(wú)植株死亡。 暗處理1～7 d均能促進(jìn)試管苗生長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)較好，無(wú)死亡情況。其中，暗處理3 d的效果最好，增殖系數(shù)和生長(zhǎng)量均顯著高于對(duì)照組，無(wú)死亡現(xiàn)象。4 ℃低溫處理的試管苗增殖系數(shù)隨著處理天數(shù)的增加逐漸減小，死亡率逐漸上升，處理5 d死亡率達(dá)12.78%。以上不同處理效果最好的是暗處理3 d，增殖系數(shù)為2.30，生長(zhǎng)量可達(dá)0.39 g。

表1 第30天時(shí)不同抗褐化處理的‘鳳丹’試管苗褐化及生長(zhǎng)情況Table 1 Browning and growth of P.ostii var. ‘lishizhenii’ tube seedlings under different anti-browning treatments on 30th day

2.3 抗褐化處理對(duì)‘鳳丹’試管苗生理生化的 影響

2.3.1 總酚含量 以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 0.115 4x，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 4，表明標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度線性關(guān)系良好，x的單位是μg/mL。不同抗褐化處理總酚含量變化如圖2-A所示。在處理10 d時(shí)，對(duì)照及不同抗褐化處理的總酚含量與0 d時(shí)相比均有顯著上升，分別增加54.64%、 43.83%、29.13%、46.32%、36.80%。隨后，總酚含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。各處理在30 d的總酚含量分別低于對(duì)照組13.68%、20.82%、 9.94%、18.09%，表明各處理均能降低酚類物質(zhì)的含量。處理培養(yǎng)30 d時(shí)，除暗處理3 d組外的其他處理總酚含量均顯著低于對(duì)照組(P< 0.05)，其中添加AgNO360 mg/L處理的總酚含量最低，僅為287.27 mg/kg。

2.3.2 多酚氧化酶活性 不同抗褐化處理的PPO活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖2-B)。對(duì)照及不同抗褐化處理的總酚含量與0 d時(shí)相比均有顯著上升，增幅依次為對(duì)照 15.57%、暗處理3 d 12.69%、Vc 75 mg/L 8.87%、4 ℃低溫3 d 5.07%、AgNO360 mg/L 3.61%，可以得出各抗褐化處理組均能一定程度降低PPO活性。培養(yǎng)10～30 d，各處理的PPO活性逐漸降低。各處理在30 d的總酚含量分別低于對(duì)照組6.52%、9.68%、4.93%、6.94%， 但差異不顯著(P>0.05)。其中，添加AgNO360 mg/L處理的PPO最低，僅為74.35 U/(g·min)。

2.3.3 超氧化物歧化酶活性 抗褐化處理的SOD活性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖2-C)。培養(yǎng)10 d時(shí)，除對(duì)照組和 4 ℃低溫3 d外其余組與0 d相比均顯著上升，分別為31.15%、38.08%、28.28%。除4 ℃低溫3 d外，各處理30 d的SOD活性均高于對(duì)照組，各抗褐化處理的SOD活性依次為AgNO360 mg/L>Vc 75 mg/L>暗處理3 d>對(duì)照>4 ℃低溫3 d，但差異不顯著(P>0.05)。其中添加AgNO360 mg/L的SOD活性最高，高于對(duì)照15.77%。

2.3.4 過(guò)氧化物酶酶活性 不同抗褐化處理的POD活性(圖2-D)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。各處理10～30 d，POD活性均高于對(duì)照組，且與0 d的POD活性差異顯著(P<0.05)；處理10 d時(shí)，分別上升46.26%、87.04%、113.94%、81.52%，60.97%，表明各抗褐化處理均能提高POD活性。培養(yǎng)30 d時(shí)，AgNO360 mg/L和 3 d 4 ℃低溫處理的POD活性顯著高于對(duì)照組，其中添加AgNO360 mg/L，酶活最高可達(dá)53.32 U/(g·min)。

2.3.5 總酚含量、POD、PPO及SOD活性與褐化率的相關(guān)性分析 總酚含量、SOD、PPO及POD活性與褐化率的相關(guān)關(guān)系如表2，總酚含量與褐化率呈極顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.758；過(guò)氧化物酶(POD)活性與褐化率呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.610；多酚氧化酶(PPO)活性與褐化率呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.527；超氧化物歧化酶(SOD)活性與褐化率無(wú)明顯相關(guān)性；總酚含量與POD呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.740。

表2 總酚含量、POD、PPO及SOD活性與褐化率的相關(guān)性分析Table 2 Correlations between browning degree,total phenolic content and activities of POD, PPO and SOD

3 討 論

抗氧化劑和吸附劑等常用于牡丹組織培養(yǎng)的褐化抑制，‘烏龍捧盛’(Paeoniasuffruticosacv. ‘Wulongpengsheng’)培養(yǎng)基中加入2 mg/L的AgNO3能有效控制褐化，并促進(jìn)組培苗生長(zhǎng)與增殖[19]?！尻?yáng)紅’(Paeoniasuffruticosacv. ‘Luoyang Red’)培養(yǎng)基中附加0.5 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可減輕試管苗褐化[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的Vc、AgNO3及黑暗、4 ℃低溫處理能夠有效防止‘鳳丹’試管苗褐化，促進(jìn)生長(zhǎng)。添加60 mg/L AgNO3抑制褐化效果最佳(表1)，褐化率降至23.33%，植物受傷產(chǎn)生大量乙烯致使試管苗褐化，銀離子可破壞乙烯受體，抑制培養(yǎng)物褐化的發(fā)生。但是隨著銀離子濃度的升高，褐化也加重，這可能是高濃度的銀離子使培養(yǎng)物中毒所致[21-22]。暗處理3 d促進(jìn)生長(zhǎng)(表1)，增殖系數(shù)增至2.30，生長(zhǎng)量較對(duì)照組增長(zhǎng)0.15 g。該結(jié)果與程強(qiáng)強(qiáng)等[23]對(duì)蝴蝶蘭(Phalaenopsis)不定芽擴(kuò)繁的研究結(jié)果一致。暗處理使細(xì)胞內(nèi)GA含量升高，GA可促進(jìn)細(xì)胞延長(zhǎng)[24]。因此，較短時(shí)間的暗培養(yǎng)有助于‘鳳丹’芽的增殖和生長(zhǎng)。

‘鳳丹’試管苗褐化率與總酚含量呈極顯著正相關(guān)。因此降低總酚含量可以有效地減輕褐化。由于不同物種或同一物種的不同部位酚類物質(zhì)種類和含量不同[13,25]，幼嫩的、活力旺盛的組織中酚類化合物積累較少，其褐化也較輕微。在實(shí)際操作中，選擇幼嫩的、生命活力旺盛的材料，如胚、分生組織等，便于建立抗褐化培養(yǎng)體系?！P丹’中酚類物質(zhì)種類及含量對(duì)組織褐化抑制也至關(guān)重要，相關(guān)研究有待進(jìn)行?？偡雍颗cPOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，F(xiàn)rancisco等[26]發(fā)現(xiàn)POD利用培養(yǎng)物受傷后釋放的H2O2來(lái)催化酚類物質(zhì)氧化。因而可通過(guò)提高POD活性使更多酚類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，具體結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。

褐化率與總酚含量和PPO、POD及SOD酶活變化的關(guān)系在多個(gè)物種中都有報(bào)道。許傳俊等[27]發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭(Phalaenopsis)外植體褐變與PPO、POD的活性呈正相關(guān)。Boonsiri等[28]對(duì)低溫貯藏的尖辣椒(CapsicumannuumL.)種子褐變研究發(fā)現(xiàn)褐變與POD呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果表明褐化率與PPO酶活呈顯著正相關(guān)，而與POD酶活呈顯著負(fù)相關(guān)，而SOD與褐化率并無(wú)顯著的相關(guān)性，這一結(jié)果與其他物種中褐化與酶活關(guān)系的研究結(jié)果有相似但也有所不同[27-30]。PPO在植物體中催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)經(jīng)非酶促聚合生成有害褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)物死亡[31]。POD可催化清除組織中的H2O2和超氧陰離子，保護(hù)細(xì)胞膜透性，抑制褐變發(fā)生[32]。這表明PPO和POD與降低‘鳳丹’試管苗褐化關(guān)系密切。反義PPO基因可抑制多酚氧化酶活性，降低酚類物質(zhì)含量以減輕馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)塊莖損傷褐化[33]。在后續(xù)研究中，可通過(guò)尋找并調(diào)節(jié)與酚類含量相關(guān)的酶及其基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制‘鳳丹’植物組織培養(yǎng)褐化的目的，有關(guān)研究將根據(jù)需要不斷深入，為其優(yōu)質(zhì)苗木規(guī)?；a(chǎn)提供理論和技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

本研究以‘鳳丹’試管苗為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加硝酸銀60 mg/L褐化抑制效果最好，3 d暗處理增殖效果最好；試管苗總酚含量、多酚氧化酶(PPO)與褐化率呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，過(guò)氧化物酶(POD)顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)無(wú)顯著相關(guān)性，總酚含量與POD呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，表明PPO和POD與 ‘鳳丹’試管苗褐化關(guān)系密切，其調(diào)控及基因的表達(dá)有極大的研究?jī)r(jià)值。